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实验十 植物DNA抽提
实验10、植物DNA的抽提和酶切;掌握植物总DNA的抽提方法和原理;植物DNA提取主要方法:SDS法、CTAB法;四、仪器设备;六、试剂;水稻基因组DNA的微量抽提;将水稻叶片约0.1~0.2 g,放入预冷的研钵中,加入液氮,将叶片研磨成粉状;将粉末倒入2ml离心管中。注意:动作迅速,不要让粉末解冻。
加入0.8毫升在65℃水浴中预热的抽提缓冲液,混匀,放入65℃水浴中保温20~30分钟 (期间每隔5分钟轻轻摇动一次离心管)。
加入0.8 ml氯仿:异戊醇:乙醇(76:4:20),混匀后,平放在振荡器上摇动10分钟(振荡频率以抽提液与氯仿完全混合为度)。
离心15分钟(12000 rpm、20℃),将上清液吸入一个新的2 ml离心管(记录体积)。
加入1/10体积的3M NaAc和等体积的冷异丙醇,轻轻混匀,静置5 min。
12000 rpm离心5 min收集沉淀。弃上清,用0.5 ml 70%乙醇洗沉淀两次,每次12000 rpm离心5 min。弃乙醇后短暂离心用移液器除去乙醇后于热板上(45 ℃ )干燥1 min。
加入100 ul 1×TE溶解沉淀,并与65℃下保温10 min,期间混匀几次。加5 ?l 10 mg/ml 的RNaseA,37度消化1小时,之后直接纯化或于-20℃冰箱保存。 ;合并所提DNA,调整体积到300ul,然后加入等体积的酚/氯仿,充分轻柔上下翻转混匀10分钟,之后于12000rpm离心10min。吸取上清到另一支1.5mL离心管,加入等体积氯仿抽提10分钟,之后于12000rpm离心10min (4度) 。
吸取上清到另一支1.5mL离心管,再加入1/10体积的3M NaAc和2.5倍上清体积的预冷的无水乙醇,混匀后置于-20℃冰箱中15min,取出后12000rpm离心10min(4度)。
去尽酒精,用500μL 70%乙醇洗涤沉淀,12000rpm离心2min(4度) 。
去尽酒精,风干,溶解于20μL-30uL 1×TE(可先在热板上预热到65 ℃)中。
电泳检测,取1ul DNA稀释10倍,之后取1ul 稀释的DNA配制点样体系:1μL DNA+8μL dH2O+1μL 10×loading buffer。用未酶切的λ DNA作为DNA分子量标记和定量marker。
注:氯仿抽提时,要保证抽提液中有一定的盐溶液,否则DNA进入沉淀。;在氯仿中加入0.3%乙醇可以消除挥发在空气中的毒性。
氯仿毒性主要体现在两个方面:
(1)本身是有毒的,其蒸汽挥发到空气中造成污染;
(2)在光照下会和氧气缓慢反应,产生毒性更大的气体—光气。
所??,氯仿在成品售出前,首先要用深色玻璃瓶封装,防止产生光气;其次要加入少量的乙醇,乙醇会和光气反应生成无毒的碳酸二乙酯。另外,乙醇等无毒物质覆盖在氯仿的液面上还能防止氯仿本身的挥发。;水稻基因组DNA的酶切;;思考题;水稻基因组DNA及酶切;DNA降解;03-8-17-DNA-1
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