分子生物学实验的常见问题及解决方案.pdf

东华理工大学分子微生物实验室 核工楼 413 郭勤总结 参考胡老师博客 /molecularbiologyofcell 分子生物学实验的常见问题与解决方案-1 一、Southern 杂交 问题 1：电泳后发现凝胶中DNA 扩散，导致结果难以确定，如何解决这一问题？ 解决方案： （1）在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶及时处理使凝胶 干燥；（2）琼脂糖的质量应该较好，尤其是不应含有内切酶，否则有时将使低 拷贝数基因的杂交结果难以解释。 问题2：传统方法中转膜不完全的问题如何克服？ 解决方案：经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至 24 小时以上,也不能使大分子 DNA 良好地转移出去,因此,转膜不完全。向下转膜 法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到 的重力方向一致,故可以良好地完成 DNA 的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度 较快,转移效率高。 利用地高辛标记探针进行 Southern 杂交时，对于大于 15kb 的 DNA 片断，转膜 之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率, 但脱嘌呤过度可导致分子量相对较 小的 DNA 被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。如果实验转膜过程中同时 含有大于 15kb 的DNA(通常为基因组)和小片段 DNA(通常是基因组酶切产物)， 那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这样既可以提高 大片断 DNA 的转移效率，又不会打碎小片段DNA。 另外，等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法，来解决这一难题：以转基因鼠的检测 为例，实验步骤如下：1.转基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5’调控 区指导人 G-CSF 基因为构件，建立转基因小鼠。转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾 DNA 做 Southern 进行鉴定。2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用 BanHI(150U)对由假孕 鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μ g 酶切过液，取少量电泳检查酶切完全后， 上样电泳 8 小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置 50℃放置 3 小时，用镊子轻轻揭起 凝胶，放于变性液 (0.5MNaOH，0.5MNaCl)20 分钟，转置中和液(0.5MTrisHCl， 0.15MNaCl)20 分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置 30 分钟。(3)干胶 应立即杂交。先将胶在水中泡一下，以利于操作。 (4)将胶放人杂交液 (6×SSC、 5×Denhardt’S、0.25% SDS、100μ g/ml 鲑鱼精 DNA)，加人探针，42℃杂交 16-20 东华理工大学分子微生物实验室 核工楼 413 郭勤总结 参考胡老师博客 /molecularbiologyofcell 小时。(5)杂交完成后，洗膜 8 轮，42℃每次 15 分钟。2×SSC、0.1%SDS、1×SSC、 0.1SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、各洗两次，在冰水中浸泡 2 分钟，以利于盐的排出。(6)干燥后按检测试剂盒操作，室温压片 0.5-2 小时。 冲片照相。使用的探针为 G-CSF。DNA，探针标记采用Fluorescein-12-dUTP，检 测试剂盒为杜邦公司产品，操作按试剂盒说明书进行。用琼脂糖凝胶直接杂交的 方法，较好地解决了微量核酸或低拷贝数转基因的检测问题，结果不仅直观，而 且特异性好。与常规的 Southern 杂交相比，它所具有的优势是，它省略了将 DNA 进行转膜的步骤，从而避免了因转膜不完全所造成的 DNA 量的损失，特别是低拷 贝数基因的丢失。另一方面，也使复杂的 Southern 杂交操作程序大大简化。因 此，在转基因鼠的鉴定中以及微量核酸检测、疾病诊断中是防止低拷贝数基因漏 检的一种可行途径。 问题3：在向下转膜法中，如何提高转膜效率？ 解决方案：1、转移液的水平面应略低于凝胶的水平面。如果转移液的水平面高 于凝胶，短时间内会有大量液体聚集在凝胶上，直接从侧面流失；果转移液的水 平面过分低于凝胶，影响纱布的吸水力，转移效率下降。2、吸水纸吸水后易变 形，使吸水纸与滤纸间产生空隙，而降低吸水纸的吸水效率，应及时更换吸水纸。 3、过夜转移时，及时添加转移液，防吸干。4、样本丰度高时，移时间可以缩短 至 1 小时，此时凝胶上仍可见大分子量 DNA 的残留，当样本丰度低时，以延长转 移时间。5、纱