基于反相有机整体柱新型蛋白质酶反应器.PDF

第4 1 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE )摇 特约来稿 第1 期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2013 年1 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 10 ~14 DOI:10.3724/ SP.J.1096.2013.20720 基于反相有机整体柱的新型蛋白质酶反应器 1,2 * 1 1,2 * 1 刘 静 摇 王方军 摇 张振宾 摇 邹汉法 1 (中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析化学重点实验室,大连 116023 ) 2 (中国科学院研究生院,北京 100049 ) 摘摇 要摇 以牛血清白蛋白(BSA )为标准样品,以鉴定的独立肽段数目、蛋白质鉴定覆盖率和漏切率为考察指 标,通过考察酶解缓冲液、反相柱基质的多孔结构、酶解反应时间和整体柱的疏水性对反相蛋白质酶反应器酶 解效率的影响,构建了一个基于反相有机整体柱的新型酶反应器,此反应器具有制备简单、通透性好、酶解时 间短和蛋白质鉴定覆盖率高等特点。 关键词摇 反相有机整体柱;蛋白质酶反应器;液相色谱鄄质谱联用 1摇 引摇 言 随着电喷雾(ESI )和基质辅助激光解析(MALDI )等软电离技术的出现及相关质谱技术的发展,生 物质谱已成为现代蛋白质组学研究的核心技术。 基于质谱技术的蛋白质组学研究策略一般分为两种: 一种是自上而下Top鄄down 策略,一种是自下而上Bottom鄄up 策略。 由于现阶段质谱检测分子量范围和 蛋白质分子低溶解度、低离子化效率的限制,Bottom鄄up 分析策略应用更为广泛。 Bottom鄄up 策略基于对 酶解肽段的鉴定实现对蛋白质的鉴定,因此蛋白质的酶解是该分析策略的关键步骤之一。 常规溶液酶 解耗时长、操作繁琐、分析通量低,且后续的除盐步骤会造成严重的样品损失,不适于微量复杂蛋白质样 品的分析。 蛋白质酶反应器是用于蛋白质样品预处理及酶解的微流器件,主要分为固定化酶反应器和 [1,2] 吸附型酶反应器两种 。 前者将蛋白酶固载在固相基质上,蛋白质在通过固相基质的过程中完成酶 解;后者将蛋白质样品和蛋白酶通过离子交换等作用吸附在固相基质上面,通过调节pH 值活化蛋白质 酶进行酶解。 蛋白质酶反应器可实现蛋白质除盐纯化、修饰蛋白质富集等样品预处理与蛋白质酶解的 [3 ~7] 集成,减少分析过程中的蛋白质样品损失,从而提高分析通量和检测灵敏度 。 整体柱因其制备简单、通透性好、传质速度快等优点,在蛋白质酶反应器中被广泛应用。 甲基丙烯 酸缩水甘油酯鄄二甲基丙烯酸乙二酯(GMA鄄EDMA )有机聚合物整体柱和有机鄄无机杂化整体柱材料都 [8 ,9] 被用作蛋白酶的固载基质,实现了蛋白质样品的快速、高效酶解 。 但是固定化酶反应器的酶固载反 应耗时长、操作繁琐且固定化过程易影响酶活性。 吸附型酶反应器无需酶固载步骤,操作简单,更容易 [10] 实现多次重复使用。 Tian 等 发展了磺酸基强阳离子交换整体柱吸附型胰蛋白酶反应器,对干细胞样 品进行了大规模、高灵敏度和高准确度的定量蛋白质组分析。 现有的吸附型酶反应器一般基于强阳离子和强阴离子交换色谱基质,尚无基于反相色谱基质的吸 附型酶反应器的研究报道。 这主要是由于反相色谱基质对蛋白质和蛋白酶的吸附作用较强,无法通过