高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体课件.doc

高效率构建包含内含子的hpRNAi植物载体 摘要 在植物基因功能分析中广泛使用的双链RNA干扰（RNAi）是一种高效率的系统，对于制作发夹RNA（hpRNA）结构有一个很大的需求量。在这里，我们描述了一种新的限制性连接方法，提供了包含内含子的hpRNA（ihpRNA）载体的一种简单而高效的建设。该系统以优势型IIS的限制性内切酶BsaI和我们新的植物RNAi载体pRNAi-GG（GG）以GG克隆为基础。这种方法需要有感兴趣的基因的BsaI识别序列侧翼只有一个单一的PCR产物，然后可以克隆到pRNAi-GG上在正方向和反方向同时形成ihpRNA的构造。在这个过程中，在一个管与一个限制性连接步骤完成后，产生的重组ihpRNA具有高效率和零背景。我们证明与pRNAi-GG载体向量生成的ihpRNA结构的效用有效沉默各种单独的内源和外源标志物基因以及同时沉默这两个基因。此方法提供了植物功能基因组学的大规模分析的新颖的和高效率的平台。 介绍 在双链RNA被发现作为一体的能触发RNA干扰（RNAi）之后[1]，RNA干扰也成为一个基因功能[2-4]分析的最强大的工具。 发夹RNA（hpRNA）结构通常用于通过RNA干扰[5]的机制来诱导靶基因的degra-dation。在植物中，含有发夹RNA的内含子（ihpRNA）配有一个内含子作为间隔序列表示出了最高基因沉默效率[6]。因此，ihpRNA结构已被广泛用于植物中的基因沉默。与在植物中基因序列的爆炸性释放和基因组序列，高效率和成本制作ihpRNA结构系统需求量很大。 为了便于ihpRNA结构的产生，几种方法已经被报道。传统的连接酶的载体如pHANNIBAL和pKANNIBAL首次使用生成ihpRNA结构[6]。该方法需要几轮限制和连接，并且因此，比较乏味和耗时。有一种可替代地方法，GATEWAY克隆系统为基础的RNAi载体如pHELLSGATE系列和PIPK系列已被广泛用于产生ihpRNA结构[7-9]。在这个系统中，一个单一的PCR产物，从含有适当attB1和attB2位点的引物，可以是同时重组到载体中以形成所述两个臂的发夹。因此，它比传统的基于连接酶的系统更简单和更快速。然而，该方法通常需要两个克隆步骤，包括BP和LR反应生成最终ihpRNA。此外，使用的试剂系统是相当昂贵的，特别是对在发展中国家研究人员。除了传统的基于连接酶系统和GATEWAY系统中，几个重叠扩展（OE）PCR方法被开发来构建ihpRNA盒子。一个叫DA-ihpRNA方法，用于直接从基因组DNA扩增ihpRNA结构，被描述Xiao等[10]。我们实验室先前报道的混合单步骤OE-PCR方法，通过组装靶基因的两个反向重复片段并且在一个管内的内含子[11]产生ihpRNA结构。陈等人采用了类似的策略构建其立即插入由TA克隆[12]的最后的植物表达载体ihpRNA盒子。这些基于PCR的方法不仅比常规的基于连接酶系统更简单和快速，而且比GATEWAY系统还更有成本效益。然而，它们有时会遭受低的效率，因为PCR抑制效果导致两个反向重复序列，特别是对于那些靶基因序列的自退火包含富含GC的区域和/或可以形成序列二级结构。最近，对于一个一步法构建hpRNA的100％的效率是基于连接独立克隆（LIC）使用pRNAi-LIC载体，已经被发现[13]。这种方法简单快捷，因为它可以生成ihpRNA结构用一步法转换用于植物RNA沉默。但是，它仍然需要两轮PCR为扩增不同适配器的两个反向重复和一系列的限制性酶切的矢量线性化在使用ligation-独立克隆之前。 为了开发制作一个更简单的RNAi构建系统，我们采用的是Golden Gate（GG）克隆的方法。此克隆策略依赖于IIs型限制性酶，其切割产生的DNA突出端被任意定义在识别序列外侧。此属性已被用于在单个连接反应中开发多种DNA片段的高效定向组件协议[14,15]。此外，在切割位点的适当的设计，二消化的片段可被连接，以产生缺乏原始的限制性位点的产物。由此，消化和连接这两个步骤可以由一个单一的限制性连接步骤所取代。根据Golden Gate克隆的这些特性，我们在这里描述，通过我们新的植物RNAi载体pRNAi-GG的构建，一步法和成本效用能产生ihpRNA有效的方法。利用这个系统，一个植物ihpRNA表达载体可以从感兴趣的基因的单一PCR产物通过单管限制性连接反应和一步转化制成。该方法已成功地应用于产生ihpRNA构建其他各种内源性和外源性标记基因以及两个基因同时有效沉默。我们的结果表明，这种新方法提供了一种制造ihpRNA构建体的高通量和可靠的平台，由此，可以促进在植物中的一个大型功能基因组学分析。 结果 为了构建ihpRNA载体而发展Golden Gate策略 通过使含内含子的反向重复快速和