手足口病标本采集与检测技术方案.docVIP

附件1 手足口病 一、标本种类运（一）粪便标本采集病人发病日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量58g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存12内送达实验室，20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70℃冰箱。 （二）咽拭子标本采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有35ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。4℃暂存送达实验室，20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70℃冰箱。 （三）血清标本采集急性期（发病0d）和恢复期（发病1430d）双份配对血清用于静脉采集35ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于20℃以下冰箱中冷冻保存。 （四）疱疹液在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有35ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。（）脑脊液标本出现神经系统症状的病例，采集脑脊液标本，进行检测。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.02.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。脑脊液、标本采集注意事项 在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离病毒。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在保存液中，如维持液。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。 保存液 Eagle`s液(MEM) ml 3%L-谷氨酰胺200mM 1.0ml 胎牛血清 .0ml 7.5%NaHCO3溶液 3.5ml 青链霉素 10ml 三、实验室检测（一）病毒分离1.试剂配置 （1）生长液、维持液的配制见下表 生长液（GM） 维持液（MM） Eagle`s液(MEM) 86.5ml 92.5ml %L-谷氨酰胺200mM 1.0ml 1.0ml 胎牛血清 10.0ml 2.0ml 7.5%NaHCO3溶液 2.5ml 3.5ml 青链霉素 1.0ml 1.0ml （2）粪便标本的处理液 完全PBS液中加入P．S溶液，终浓度为青霉素00单位/ml，链霉素为00μg/ ml。完全PBS液 NACL 8.00g KCL 0.20g Na2HPO4(无水) 0.91g KH2PO4 0.12g 用600～800ml蒸馏水溶解以上盐类，加蒸馏水补至1000ml，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌，即为不完全PBS工作液（不含钙、镁离子）。 B液： 试剂品名 加入量 MgCl2.6H2O 0.10g 溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。 C液： 试剂品名 加入量 CaCl2 0.10g 溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。 2．病毒分离细胞系 许多细胞系可支持人肠道病毒（、CA16）生长。 对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含、CA16等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系： RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。 HEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞。3．标本的处理 （1）粪便标本的处理 操作步骤在离心管上标记标本号； 每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿； 在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于－20； 确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min； 在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min； 在生物安全柜中将每份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理次）； 管粪便悬液冻存于－20作为备份，另管存于48℃以备接种。（2）疱疹液标本的处理 疱疹液标本通常直接用于病毒分离。 （3）脑脊液标本的处理 脑脊液标本通常直接用于病毒分离。 （4）咽拭子标本的处理 咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下）