临床聚合酶链反应试剂盒的选用和质检.ppt

* 临床聚合酶链反应试剂盒的选用和质检 武汉大学中南医院检验科 郑芳 大 纲 荧光定量PCR试剂盒的组成 荧光定量PCR试剂盒的评价指标 影响PCR试剂盒质量的因素 临床PCR试剂盒的选用原则 一、荧光定量PCR试剂盒的组成 核酸提取试剂 核酸扩增试剂 质控品 寡核苷酸引物和探针 扩增缓冲液 dNTP Taq酶以及反转录酶 核酸的提取 数据的分析 外观和物理性状 阳性参考品/阴性参考品 重复性 敏感性 二、荧光定量PCR试剂盒的评价指标 1. 数据分析——基线和阈值的设定 确定正确的基线 设定合适的阈值 基线的缺省值在3～15循环 确定正确的基线 阈值线的缺省值是基线荧光信号强度标准偏差的10倍 可以将阈值线的光标移到符合下列条件的扩增曲线的位置： 指数扩增的线性阶段 精密度最大 敏感性最大 标准曲线法 斜率的绝对值接近3.322 R2接近1 较好的区分样品 重复 平行样的Ct值之间的差0.5 设定合适的阈值 观察结果，记录 值和定量结果，应符合以下要求： 阴性质控品：检测通道扩增曲线无对数增长期； 阳性质控品：检测通道扩增曲线有明显对数增长期，呈典型 S 型扩增曲线，检测浓度在某一范围内； 定量参考品：均检测为阳性，且标准曲线相关系数R2 0.98 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效 2. 外观和物理性状 外包装的检查包括厂家名称、检测目的、批准文号、批号和有效期等，可防止使用假冒伪劣或过期试剂。 内包装的检查主要是看试剂瓶是否漏液、真空包装是否破损、试剂是否齐全以及是否有使用说明书等。 3. 阳性参考品/阴性参考品 阳性参考品 1 套，至少应包含 2-5 种不同来源的 各自有独特代表性的阳性样本，如不同人群 不同感染阶段 同种病原微生物的不同亚型，特别应注意强阳性样本和弱阳性样本和临界阳性样本的选择 阴性参考品1套，一般应不少于10 种不同来源的，相对于该项测定是阴性的样本，应包含：不同年龄组、不同人群、同种病原微生物的不同亚型基因结构相似的不同病原微生物临床症状相似的不同病原微生物等 表 试剂盒评价四格表 被检试剂盒结果 阳对结果（＋） 阴对结果（－） 合计 （＋） a b a+b （－） c d c+d 合计 a+c b+d a+b+c+d 表中a为真阳性，b为假阳性，c为假阴性，d为真阴性。 特异性(％) = d/(b+d)×100％ 灵敏度(％) = a/(a+c)×100％ 符合率(％) = a+d/(a+b+c+d)×100％ 理想情况下，试剂盒的特异性、灵敏度及符合率应为100％。 弱阳性(低拷贝数)质控物进行质检。 在每次临床检测中，同时带上弱阳性质控物与临床标本一起检测，对判断试剂盒的质量及其稳定性具有重要的参考价值。 4. 重复性/精密度 评价试剂盒对同一样本重复测定时能否得到相同结果的指标，通常用变异系数（CV）表示 同一批号试剂对同一样本重复测定（10 次）， CV应不大于 10.0% 一种方法是确定 1 份阳性样本，同一批号试剂对该样本重复测定不少于10次，CV应不大于 10.0%（高拷贝、中拷贝、低拷贝、阴性） 另一种方法是确定一套定量线性参考品，要求测定结果在其靶值范围内，且线性相关系数R2=0.990 将精密度参考品分别进行核酸提取 PCR 扩增等步骤，检测结果浓度值（拷贝数/mL）的 CV较大，而检测结果 Ct值的较小，以浓度值计算CV值可以较真实的反映试剂盒的精密度，Ct值反映则不显著 5. 敏感性/灵敏度 通常灵敏度通过最低检出限来反映，是评价试剂盒质量的重要技术指标，因为极少量的分析物可能对界定疾病状态 疾病筛查或揭示是否存在病原体等具有重要意义 以甲型 H1N1 流感病毒核酸国家最低检出限参考品为例：将灭活的 A Beijing SWL5 2009N1）病毒培养液倍比稀释，制备系列梯度参考品S1-S5 协同标定结果表明，在S1-S3 范围，值稀释倍数符合线性比例关系，S3-S4 进入平台值与稀释倍数已不符合线性比例关系，即相对应的值稀释倍数差异较大。因此甲型1 流感病毒核酸国家最低检出限参考品将 S3定为最低检出限 乙型肝炎病毒核酸和甲型 H1N1流感病毒核酸国家参考品质量标准 三、影响PCR试剂盒质量的因素 内在因素 标本处理、用于核酸扩增的原材料及方法学设计 核酸提取的有效性 核酸提取的简便性 外在因素 试剂盒出厂后在运输和储存中所存在的问题 样本检测结果与样本收集 、处理、运送及保存有关，其中任何失误均会导致结果不准确 实验中的交叉污染，可能导致假阳性结果出现 实验过程应严格分区进行 所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段应使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用