EHA105电击 电转感受态细胞使用说明.pdfVIP

EHA105 电击/电转感受态细胞 EHA105 Electroporation Competent Cell 编号 名称 规格 北京华越洋WG 07236 EHA105 电击/电转/转感受态细胞 10 ×50ul EHA105 电击/电转感受态细胞基因型： r C58 (rif ) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) Succinamopine EHA105 电击/电转感受态细胞说明： EHA105 菌株由EHA101 菌株改造而来，为C58 型背景，核基因中含有筛选标签——利福 平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti 质粒 pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir 基因 (vir 基因是T-DNA 插入植物基因组 必需的元件，pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA 转移功能被破坏，但可以 帮助转入的双元载体T-DNA 顺利转移)。EHA105 菌株适用于水稻、烟草等植物的转基因操 作。唯地生物开发的EHA105 电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pCAMBIA2301 质 5 粒 (size:11633 bp)检测转化效率10 cfu/μ g DNA；经pCAMBIA2301-ZH 质粒 3 （size:40 kd）检测转化效率可达5×10 cfu/μ g DNA。 EHA105 电击/电转感受态细胞操作方法： 1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5 分钟，待其沥干水分，正 置5 分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面 0.5 cm 以方便盖上杯盖，冰中静置5 分钟充分降温。 2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5 分钟，待其融化，加入 1-5 μ g 质粒DNA （质 粒体积不大于6ul，最好用试剂盒抽提，双蒸水溶解），用手拨打管底混匀，立即插入冰 中，用200 μ l 枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。 3. 启动电转仪，设置参数：C=25 μ F，PC=200 ohm，V=2400 V （此参数为Biorad 推 荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol 操作），将电击杯快速放入电转槽中，电 击完成快速插入冰中，加入700 μ l 无抗生素的LB 并转移到感受态空管中，28℃振荡培 养2~3 小时。 4. 6000 rpm 离心一分钟收菌，留取 100 μ l 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生 素的LB 或YEB 平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3 天（当平板只含有50 μ g/ml kan 时，28℃培养48 h 即可；平板中同时加入50 μ g/ml kan，20 μ g/ml rif 时，需 28℃培养60 h；如果使用的平板含有50 μ g/ml rif 则需要28℃培养72-90 h）。 EHA105 电击/电转感受态细胞注意事项： 1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的 1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化 效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。 2. 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。 3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大 的菌落，应减少质粒用量。 4. 利福平浓度不应高于25 μ g/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速 度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μ g/ml kan，若所用平 板含有20 μ g/ml rif 则转化效率降低到1/2。 5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入Ti 质粒 筛选抗生素可防止Ti 质粒丢失，但Ti 质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作，所以 一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素，Ti 质粒