生物化学实验总结.ppt

3.6.2 米氏常数Km的意义 不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。 Km值只是在固定的底物，一定的温度、pH以及一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低； Km值小表示亲和程度大，酶的催化活性高。 3.6.3 米氏常数的求法 V：酶促反应速度 Vmax：酶促反应最大速度 [S]：底物浓度 Km：米氏常数 1 V = Km Vmax × [S] 1 1 + Vmax 3.6.4 双倒数作图法 3.7 酶活性测定的应用 LDH活性的测定 碱性磷酸酶Km值的测定 ALT/GPT活性的测定 实验考试和考核方法 总分100分 实验笔试 ：70％ 实验报告：15％ 平时成绩：15％ 1.2.5 层析的应用 离子交换层析分离混合氨基酸 用磺酸型阳离子交换树脂分离酸性氨基酸天冬氨酸（2.97）和碱性氨基酸赖氨酸（9.74）。 方法 ：改变洗脱液的pH值（ pH 5.3－ pH 12） 结果：天冬氨酸先被洗脱下来，赖氨酸后被洗脱 下来 1.2.5 层析的应用 凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白 结果：红色的色带(分子量大的血红蛋白)先洗脱下来，黄色的色带(分子量小的DNP-鱼精蛋白)后洗脱下来 1.2.5 层析的应用 基因工程菌中（谷胱甘肽巯基转移酶）GST的亲和层析分离 琼脂糖凝胶颗粒手臂上的谷胱甘肽可以与GST蛋白特异性结合，通过洗脱除去不能与其结合的杂蛋白，然后使用还原型谷胱甘肽(GSH)洗脱，GSH竞争GST上的结合位点而将GST蛋白洗脱下来，从而获得纯化的GST酶的纯品。 结果：SDS鉴定为一条区带 1.3. 排除法 真核细胞DNA的分离与纯化 实验设计思路： 用双蒸水的低渗环境使细胞膜溶胀破裂； 加入NaI破细胞核膜，使核蛋白解离成蛋白质和核酸； 加入氯仿/异戊醇，使蛋白质变性沉淀，同时溶解脂类物质； 实验设计思路： 4. 离心后，混合物分成三相：上层为水相，含糖类、无机盐类、核酸等易溶于水的物质；中层为变性沉淀的蛋白质相；下层为氯仿相，其中含溶解的脂类物质； 5. 移取上层液，加入异丙醇沉淀DNA； 6. 离心后，弃去上清，将剩下的沉淀部分用70%的乙醇洗涤。沉淀干燥后，加入TE缓冲液或双蒸水溶解DNA，即得到纯化的DNA样品。 二、物质含量（或浓度）的测定 2.1 吸光光度法 基于物质对不同波长的光具有选择性吸收而建立起来的分析方法。包括比色法、可见光及紫外分光光度法、红外光谱法等。 远紫外 近紫外 可见光 近红外 中红外 远红外 （真空紫外） 10nm~200nm 200nm ~380nm 380nm ~ 780nm 780 nm ~ 2.5 ?m 2.5 ?m ~ 50 ?m 50 ?m ~300 ?m 光学光谱区 可见光：人眼能感觉到的光（380~780nm）叫可见光。白光是由红橙黄绿青蓝紫七种不同颜色的光按一定强度比例混合而成，称为复合光，只有一种颜色的光即单一波长的光称为单色光。 2.1.1 物质对光的选择性吸收 同一物质对不同波长的光吸收能力不同； 不同物质对同一波长的光吸收能力不同。 蛋白质最大吸收峰波长为280nm 核酸的最大吸收波长为260nm 2.2 光吸收基本定律:Lambert-Beer定律 A — 吸光度(absorbance) b — 溶液厚度(length/cm) c — 浓度(concentration) k — 吸光系数(absorptivity)与物质性质、温度、波长有关； Lambert-Beer定律的物理学意义：当一束平行的单色光通过均匀透明的溶液时，该溶液对光的吸收程度与溶液中物质的浓度和光通过的液层厚度的乘积成正比。 A=kbc 吸收光谱曲线特征： 物质对光的吸收是选择性吸收；不同物质对光的吸收范围、强弱不同； 吸收的波形与物质性质有关，与浓度无关； A值最大时的波长称λmax；在λmax时测量A灵敏度最高。 吸光系数k k的物理意义是： 吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。在给定条件（单色光波长、溶剂、温度等）下，k是物质的特征性常数 a的单位: L·g-1·cm-1 当c的单位用g·L-1表示时，用a表示， A＝abc ?的单位: L·mol-1·cm-1 当c的单位用mol·L-1表示时，用?或EM表示. ?或EM －摩尔吸光系数(Molar absorptivity) A＝ ?bc 吸光系数k 当c的