单细胞实验技术.doc

一、单细胞裂解（3h） 1、 UP1引物定容到 0.5um：1ul的UP1引物（100um）加入199ul去核酸酶H2O中，用小管盛装，并充分混匀；（所有的引物序列都列在表1） 2、准备细胞裂解液（4.45 ul每个样品），使用0.5ml 薄壁PCR管，加入并混匀以下组分： 组分 最终浓度 体积（ul）（1×） 体积（ul）（6×） 10×PCR buffer II（无MgCl2） 0.9× 0.45 6 25mM MgCl2 1.35mM 0.27 － 10% NP40 0.45% 0.225 1.35 0.1 M DTT 4.5 mM 0.225 1.35 SUPERase-In（20 U ul-1） 0.18 U ul-1 0.045 － RNase inhibitor（40 U ul-1） 0.36 U ul-1 0.045 0.54 0.5 uM UP1 引物 12.5 nM 0.125 0.75 dNTP mix （2.5 mM each） 0.045 mM (each) 0.09 0.54 Nuclease-free water － 2.975 16.17 总体积 － 4.45 26.7 注意：NP40有毒； 3、从输卵管获得四细胞时期胚胎，用口吸管转移到一滴台氏液（acidic Tyrode’s solution），以去除透明带； 关键步骤：在所有转移步骤中，在转移一个单细胞到裂解液前，需保证使用吸管时没有形成气泡。 4、将胚胎转移到无钙离子培养液中，轻轻吸动知道单个卵裂球分离出来； 5、随后将卵裂球转移到三个PBS-BSA液滴中（50-100ul），洗涤。 6、单个细胞被转移到含有4.45ul新鲜准备的细胞裂解液中（用0.5ml薄壁PCR管）。先吸一小段PBS-BSA，再吸细胞，然后全部打入裂解液中。 关键步骤：每个吸管只能用一次，不能重复利用，不能多次用于转移别的细胞到裂解液中。 关键步骤：应该有一个隐形对照样品，即没有细胞加入。 7、样品短暂离心：7500g ，30s，4℃。然后立刻放置于冰上。 8、70℃孵育90s，马上转移到冰上； 9、7500g ，30s，4℃，然后立刻转移到冰上1min。这个步骤之后，所有的mRNAs将从单细胞中释放。 二、反转录（2h） 10、加入0.45ul RT mix（如下表）到每一个管中，从而每个RT反应的体积达到5ul每管：4.45 ul 裂解液，约0.1 ul 吸胚胎时带出的PBS-BSA，以及0.45 ul RTmix。 组分 终浓度（U ul-1） 1×体积（ul） 6×体积（ul） SuperScript III reverse transcriptase （200 U ul-1） 13.2 0.33 1.98 RNase inhibitor （40 U ul-1） 0.4 0.05 0.3 T4 gene 32 protein （1-10 U ul-1） 0.07 U 0.07 0.42 总体积 — 0.45 2.7 11、50℃孵育30min； 12、逆转录酶失活，70℃，15min； 13、离心7500g，4℃,30s，然后立刻转移到冰上1min。这个步骤后，所有的mRNAs的第一条链cDNAs合成。 三、自由引物去除（2h） 14、准备核酸外切酶 I并混匀并混合以下组分，每一个反应加入1.0ul混合物； 组分 终浓度 1×体积（ul） 5×体积（ul） 10× Exonuclease I buffer 1× 0.1 0.5 Nuclease-free water － 0.8 4 Exonuclease I（5U ul-1） 0.5 U ul-1 0.1 0.5 总体积 — 1 5 15、37℃孵育30min； 16、核酸外切酶失活：80℃，25min； 17、离心7500g，4℃,30s，然后马上转移到冰上1min。此步后，所有自由UP1引物被破坏，只保留了完整的5‘cDNA末端； 四、3’Poly(A)加尾 18、准备TdT反应混合物，如下表。每个反应加入6.0ul混合物； 组分 终浓度 1×体积（ul） 6×体积（ul） 10×PCR buffer II （without MgCl2） 1× 0.6 3.6 25mM MgCl2 1.5mM 0.36 2.16 100mM dATP 3mM 0.18 1.08 Nuclease-free water — 3.66 21.96 Terminal transferase（5 U ul-1） 0.75 U ul-1 0.9 5.4 RNase II（2 U ul-1） 0.1 U ul-1 0.3 1.8 总体积 — 6 36 19、37℃孵育1