cDNA文库与PCR技术相结合的方法克隆目的基因.pdf

维普资讯 农 业 生 物 技 术 学 报 JournalofAgriculturalBiotechnology cDNA文库和PCR技术相结合的方法克隆 目的基因 aIa 鲁国东王宗华．学勤 谢联辉 、 建哀五j _ 保护系，福州350002； 2中国热带农业科学院热带生物技术国家重点实验室，海南儋州 571737) 摘 要： 建立了 一个以PCR为基础，结合 cDNA文库构建来克隆基目的方法。即通过寻找基因的保 守区段，设计合成一对特异性引物 以双链 cDNA—pBluescrlptISK载体挂接物为模板 ．利用载体上的标准 测序引物和基因的特异性引物．PCR扩增出包含 cDNA两末端部分的基因。运用该方法我们克隆了稻瘟 病菌(Mag~porthegrisea)的3一磷酸甘油醛脱氧酶基因(gpd)。与其它克隆方法相比t该方法不但稳定而且 有快速与简便的优点 关键词：基因克隆方洼 s 引 ／ 基因的克隆为分子生物学和基因工程研究的基础。近年来随着生物技术的发展，出现了越来越多 的克隆基因的方法和手段。如：基因组减法技术、转座子标记技术、差异cDNA显示技术、基因组定位 和标记技术等等 ]。但通过聚合酶链式反应(PCR)的方法克隆目的基因仍为已知的最为简便的方 法 PCR法的原理是以目标生物体的总DNA或RNA(对于RNA，需逆转录为cDNA)为模板，以人 工合成的一对寡核甘酸为引物，在适宜反应体系下，通过变’陛、退火和延伸的多次循环，扩增出介于二 个引物之间的DNA片段。若该对引物分别位于某一基因的5’末端和 3’末端，则就可以扩增出完整 的目的基因。PCR法克隆基因的关键是特异性引物的设计与合成 要在一个物种中克隆新基因，一 般的方法是参照其它物种中该基因的两末端序列，设计一对引物，但对于许多基因来说，在各物种间 的保守性并不是那么大，而且往往在基因的两末端不具保守序列，或者两末端虽具有保守序列，但该 序列不适宜设计为PCR引物。因此，采取PCR法直接克隆基因就行不通，而往往是通过在基因内部 寻找保守区段．并 之为基础设计引物，借助PCR扩增出基因的一部分，然后将该部分标记为探针， 从基因文库或eDNA文库中钓起相应的完整基因。也可以采取在cDNA的5’末端通过末端转移酶加 上同聚寡核昔酸引物，与基因内部的一端特异性引物扩增出包含cDNA5端的基因片段，利用 cDNA 3’端的寡聚核苷酸OfigodT和基因内部的另一端特异性引物扩增出包含 cDNA3’端的基因片段 。 但探针杂交从文库中钓取基因的过程较为复杂，易受假阳性的干扰 ，而cDNA末端加同聚寡核昔酸 引物的方法则极不稳定。为此，本实验建立了一个以PCR为基础 ，结合cDNA文库的构建来克隆基因 的快速方法，并用此方法克隆了稻瘟病菌的3一磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)。 2 材料与方法 2．1 材料 所用稻瘟病菌菌株 85—14B1为水稻的强致病菌株，由中国水稻研究所生物工程系提供，大肠杆 菌宿主菌株DH5a，克隆载体pBlueseriptISK(简写为pBS)均由中国热带农业科学院热带生物技术国 家重点实验室提供。包含Asperillushidulans的gpdA基因的质粒pAN522由Dr．Punt惠赠。 限制性内切酶和cDNA合成试剂盒为Promega公司产品，DNA合成试剂为ABI公司产品，地高 鲁 国东 男一1967 04出生 一博士．讲师 主要从事植物病理学和农业生物技术的教学和科研工作。 收稿 日期 ：1998一Ol一05 维普资讯 农 业 生 物 技 术 学 报 辛标记与检测试剂盒为 BoeheringerMannheim公司产品，PCR试剂盒 、T3引物 (5’ATTAACCCT— CACTAAAGGGA 3’)和 T7引物 (5’TAATAcGAcTcAcTATAGGG3)均为华美公司产品。 2．2 稻瘟病菌mRNA 的提取 培养稻瘟病菌851