1株产顺式-4-羟基-L-脯氨酸基因工程菌的构建及发酵初步优化.pdfVIP

回国 DOI: 10. 13995/j. cnki. 11 - 1802lts. 201602002 1 株产顺式-4-瓷基-L-脯氨酸基因工程菌的构建及 发酵初步优化 王付才，张震宇*，孙付保*，姚动邦，周杨 (江南大学工业生物技术教育部重点实验室，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏元锡，214122 ) 摘 要 顺式-4-爱基-L-脯氨酸是一种可用于合成多种药物和香料的手性结构物质。通过对 L脯氨酸顺式-4-经 化酶基囚的优化设计，并引入色氨酸串联启动子，构建出 1 株能表达 L-脯氨酸顺式-4-瓷化酶的重组大肠杆菌 JMI09/pEHC4 ，从而可以将游离的 L-脯氨酸转化为顺式-4-爱基-L-脯氨酸。对该菌株进行摇瓶发酵优化，得出优 选培养基为 (glL) :葡萄糖 10 ，甘油 10 ，蛋白陈 10 ， NaCl 6 ,Fe504 • 7H ,O O. 278 ,L-抗坏血酸 O. 528 , (NH 4 ) ,504 5 , K, HP04 1, Mg504 O. 2 , CaCl,O. 015 ， L-脯氨酸 4 。在该条件下发酵 12 h ，顺式-4-麦基-L-脯氨酸的产量达到 657.08 mglL ，比优化前提高了 3. 76 倍;在 24 h 时产量达到 1 582. 75 mglL。研究结果为顺式-4-疑基-L-脯氨酸的微生物 转化法生产提供了基础。 关键词 L-脯氨酸顺式-4-是化酶;密码子优化，重组大肠杆菌;微生物转化;发酵优化 L-是脯氨酸(L-hydroxyprolíne ， L-Hyp) ，是 L脯氨 生产 cis -4 -Hyp 具有操作简便、反应条件温和、副产物 少、无环境污染、成本低等多种优点，所以以微生物转 酸楚基化后的产物。根据其起基化位置及空间结构 化法为基础的 cis -4-Hyp 生产方法必然成为趋势。 的不同，可形成4 种立体异构体:反式-4-起基-L-脯氨 酸( trans -4 -Hyp )、顺式-4-捏基-L-脯氨酸(cis-4 -Hyp) 、 据报道，有多种微生物表现出 L-脯氨酸顺式-4- 是化酶(cis-P4H) 活性[9J 0 2009 年， HARA 等[阳]人首 反式-3-捏基-L-脯氨酸( trans-3-Hyp) 和顺式-3-在基­ 次发现可以将游离的 L-脯氨酸转化为 cis -4 -Hyp 的微 L脯氨酸(cis-3-Hyp) 。其中 cis -4 -Hyp 是一种重要的 手性结构物质，可以用于药物以及香料制造。特别是 生物，包括百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti) 以及盲稽中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) 。并且 在制药领域，cis -4 -Hyp 可以防止前胶原折叠成稳定 发现 C阶P4H 属于 2-嗣戊二酸依赖型双加氧酶家 的三级螺旋构象，从而减少纤维化和肿瘤细胞生长过 族[1011] ，酶催化反应需要非血红素亚铁离子以及 O 程中胶原的过度沉积[12] ，因此其可用作抗纤维化、 2