第四章基因组测定与分析.PDFVIP

/cab/xueyuanxiashubumen/nx/bioinplant.htm 《生物信息学札记》 樊龙江 1第四章 基因组测定及分析 人类基因组和其它一些生物基因组的大规模测序将成为科学史上的一个里程 碑。基因组的测序带动了一大批相关学科和技术的发展，一批新兴学科脱颖而出， 生物信息学、基因组学、蛋白质组学等便是一批最前沿的新兴学科。可以说，基 因组测序及其序列分析使整个生命科学界的真正认识了生物信息学，生物信息学 也真正成为了一门受到广泛重视的独立学科。 基因组测序及其分析实际是人类的又一场 “淘金”和 “探险”运动。哥伦布 等一大批探险家在几百年前发现了美洲、澳洲等一大批新大陆，最终使人类认识 了地球上的每一块处女地。于是有人形象地把人类目前的基因组研究形象地比喻 为“地球探险”，并把基因组研究称为基因组地理（genomic geography）。我们 不妨想象一下，人类基因组的各条染色体就如同人类基因“地球”上的 7 大洲， 寻找新基因和搞清楚基因组结构与功能的过程恰如开垦地球上的每一块处女地， 而这些处女地上可能蕴藏着无穷的宝藏。目前人类全基因组序列已基本测定完 成，另有一大批生物也已完成基因组测定或正在进行。世界上无数大型测序仪（最 好的测序仪一次可以阅读 1000 多个碱基）日夜不停地运转，每日获得的序列数 据以百万和千万计。同时，来自政府和企业的大量投资，使整个世界的测序能力 与日俱增。面对基因组的天文数据，分析方法举足轻重，大量新的分析方法被提 出和改进，大量重要基因被发现；大量来自基因组水平上的分析比较结果被公布， 这些结果正在改变人类已有的一些观念…… 第一节 DNA 测序及序列片段的拼接 一．DNA 测序的一般方法 1．DNA 测序的基本原理 DNA 序列测定的工作基础是在变性聚丙烯酰胺凝胶(测序胶)上进行的高分 离度的电泳过程。这些所谓的测序胶能在长达 500bp 的单链寡核苷酸中分辨出一 个脱氧核苷酸的差异。操作时，在相应的待测 DNA 区段产生一套标记的寡核苷酸 单链，它们有固定的起点，但另一端是按模板序列连续终止于各不相同的核苷酸。 确定每个脱氧核糖核苷酸的序列的关键，是在 4 个独立的酶学或化学反应中产生 终止于所有不同的 A、T、G、C 位点的寡核苷酸链，而这 4 个反应的寡核苷酸产 物在测序胶的相邻泳道中都能被一一分辨出来。由于在4 个泳道中再现了所有的 可能寡核苷酸链，DNA 的序列能从图 4.1 所示的 4 个寡核苷酸 “阶梯”中依次直 接读出。 实际上，从一套测序反应中所能获得的信息量受限于测序胶的分离度。虽然 最新的测序技术经常可从一套测序反应中测到高达 500 核苷酸的信息，但获得的 可靠序列信息大约在 300 个核苷酸。因此，如果待测 DNA 的区段在 300 核苷酸以 1本章部分内容参照了陈竺、杨焕明等人的文章，见：贺林．解码生命—人类基 因组计划和后基因组计划，北京：科学出版社，2000 65 /cab/xueyuanxiashubumen/nx/bioinplant.htm 《生物信息学札记》 樊龙江 内，所需的工作只是简单地将此片段克隆于合适的载体，以产生一个能方便地进 行测序的重组 DNA 分子。 对于大片段 DNA 的序列测定，往往需要将其切割成能单独进行测定的小片 段，这可通过随机的或有序的方式进行。下一节将讨论测定大片段 DNA 的策略。 目前广泛应用于DNA 序列测定的方法有酶学的双脱氧法和化学裂解法，在产 生寡核苷酸 “阶梯”的技术上，两者截然不同。酶学双脱氧法是利用 DNA 聚合酶 合成与模板互补的标记拷贝，化学裂解法是一套碱基专一的化学试剂作用于标记 好的 DNA 链。这两种方法下面将进一步描述。 图 4.1 DNA 测序的一般策略。进行 DNA 序列测定时，在 4 个独立的反应中，各 产生一套放射性标记的单链寡核苷酸，它们有固定的起点，另一端终止于不同的 A、T、G 或 C 位点。每个反应的产物在高分离度的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分级。 经放射自显影，DNA 序列可从凝胶上直接读出（奥斯伯等，1998