微生物菌种保藏管理中心操作指南.docVIP

微生物菌种保藏管理中心 ?保藏方法???冷冻干燥法、-80冻结法、 液氮超低温冻结法。冷冻干燥保藏法　　将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。　　操作步骤如下：好氧菌冷冻干燥管的制备1 安瓿管准备　　安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121下高压灭菌15-20分钟，备用。2 保护剂的选择和准备　　保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。3 冻干样品的准备　　在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。4 预冻　　一般预冻2小时以上，温度达到-20到-35左右。5 冷冻干燥　　采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。　　将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。6 真空封口及真空检验　　将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。?熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。7 保藏　　安瓿管应低温避光保藏。8 质量检查　　冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。 厌氧菌冷冻干燥管的制备　　主要程序与需氧菌操作相同，注意保护剂的选择和准备，保护剂使用前应在100的沸水中煮沸15分钟左右，脱气后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧。复苏方法——? 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，——? 将安瓿管顶部烧热，——? 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，——? 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。 -80低温冷冻保藏法　　将菌种保藏在-80冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。　　操作步骤如下：1 安瓿管的准备　　安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121下高压灭菌15-20分钟，备用。2 保护剂的选择和准备　　保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。3 微生物保藏物的准备　　在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。4 冻结保藏　　将安瓿管或塑料冻存管置于-80冰箱中保藏。5 复苏方法　　从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。 ?液氮超低温保藏法　? ?液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196的液态氮，或在-150的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。　　操作步骤如