实时定量PCR的操作流程要点分析.pdf

116 生命科学趋势 生命科学论坛精华专题 - - 2003 年 12 月 第 1 卷 第 4 期 Trends in Life Sciences 用于检测细胞基因转录水平的实时定量 PCR 的操作流程 （Real Time Quantitative PCR Protocol For Detection of Gene Expression ） 第一部分 原理 real time PCR 是普通 PCR 的一项改进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质，使得DNA 的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA 的扩增曲线（如，图一）。 图一：引自美国应用生物系统中国公司网站——实时荧光定量 PCR ——一种科学准确 的定量方法。 名词解释： Rn:一个反应管经 n 次热循环后，测得的荧光强度。 Rn+:反应管含有模板 DNA 。 Rn-:反应管含有模板 DNA 。 无模板对照：No template control ，Rn- ，理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数值。 Threshold: 荧光（Rn ）超过本底时的临界数值。 Ct: threshold cycle，临界循环数，threshold 横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。 基线：baseline, 是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所 有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。 仪器：热循环仪器（GeneAmp Thermal Cycler 9600 ）+ 电脑（装有Sequence Detection System 软件）+荧光检测系统(GeneAmp Sequence Detector 5700) （如，图二）。 117 生命科学趋势 生命科学论坛精华专题 - - 2003 年 12 月 第 1 卷 第 4 期 Trends in Life Sciences 图二，引自/ 。 全部实验包括步骤： 1，类似普通 PCR 反应的物品混合于反应管，之外还要添加荧光物质（SYBR 染料 或 TaqMan 探针）。 2 ，使用 SDS 软件标明热循环仪器中放入的所有反应管，设定热循环仪器的温度变化，存储 热循环仪器的工作情况，存储荧光信号，分析 DNA 的扩增曲线。 3，利用 SDS 输出的数据，其他专业数据处理软件，近似计算得到原始 DNA 的浓度，做必 要的误差分析。 SYBR 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 TaqMan 探针是由产荧光基团，荧光淬灭基团，与扩增子有互补的核苷酸序列组成。 GeneAmp 5700 Sequence Detector 总是在 PCR 循环的退火/延伸时间段依次收集反应馆的激 发荧光强度。 118 生命科学趋势 生命科学论坛精华专题 - - 2003 年 12 月 第 1 卷 第 4 期 Trends in Life Sciences Real time PCR 与普通 PCR 的细节上的区别还有： 使用持家基因作内部参比（endogenous control/reference，是同一种 cDNA 中的比较，并不是 同一反应管中作比较的意思）； 推荐使用 ROX(具有红色激发波长的染料)来抵消荧光背景（本底）； 用浓度（比较）确定的 DNA 来做出标准曲线（Ct——log 原始模板/DNA 浓度）。 具体情况将在操作流程中讲述。 本次实验的具体目的：测出 PTX, LPS 刺激不同时间后，DC 的基因转录变化，属于“relative quantitation (相对定量) ”。这个结果可以拿来与以前所做的 cDNA Microarray 结果（半定量） 作比较，确认或修正之。 第二部分 操作流程 一 仪器，用品，试剂 GeneAmp Thermal Cycler 9600 GeneAmp Sequence Detector 5700 电脑 Sequence Detection System 软件 数据处理软件（如，Excel ） 引物设计软件 光学管子，optical tube and cap + 架子 微量移液器（枪）+ 枪头（tip ） 离心机 + 螺旋振荡器 冰箱 冰盒 一次性手套 试剂