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 蛋白质定量分析：BCA法 生物化学教研室（303室） E-mail:dajingjing0927@126.com 有多少 内容 BCA法测定蛋白质含量 蛋白质定量分析的方法 操作注意事项 思考讨论 BCA法测定蛋白质含量 2.掌握分光光度计的使用。 实验目的 1.掌握BCA法测定血清蛋白质 浓度的原理。 实验原理 BCA (bicinchoninic acid,二辛可酸） 实验原理 562nm 实验步骤 （一）实验材料 1、器材 721型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管 2、试剂 （1）试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒 石酸钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体 混合后调pH至11.25。 （2）试剂B：4%硫酸铜。 （3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2mL，混合。 （4）蛋白质标准液：准确称取150mg牛血清白蛋白，溶于 100mL蒸馏水中，即为1.5mg/mL的蛋白质标准液。 （5）待测样品。 数据有改动 ug 1、将上述各管混匀后于37°C保温30分钟， 用562nm波长比色测定吸光度值。 2、以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵 坐标绘制标准曲线。 3、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相 应的蛋白质含量M，再计算出待测血清中 蛋白质浓度（g/L)。 （二）实验操作 蛋白质定量分析的方法 紫外线吸收法 改良微量凯式定氮法 双缩脲法 Folin-酚试剂法 考马斯亮蓝结合法 BCA法 280nm 16% 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物 紫外线吸收法 较低 快速 酪氨酸和色氨酸在280nm的光吸收 核苷酸 改良凯氏定氮 低 费时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮 双缩脲法 低 中速 肽键和碱性Cu2＋形成紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液 某些氨基酸 Lowry法 高 费时 双缩脲反应；酚试剂被还原 甘氨酸 硫醇 考马斯亮蓝法 高 快速 G-250与蛋白质结合物在595nm的光吸值 强碱性缓冲液 TritonX-100;SDS BCA法 最高 较快 肽键和碱性Cu2＋形成紫色络合物 不受去污剂、尿素等的影响 BCA法的特点 1、操作简便，快速 2、准确灵敏，试剂稳定性好 3、抗试剂干扰能力较强 4、经济实用 注意事项 1、实验分组 2、准确量取试剂，吸管残余液体要吹出。 3、平行加样，物归原位。 4、正确使用分光光度计，比色杯不润洗。 5、正确绘制标准曲线，标注名称、姓名、 仪器型号、作图时间。 6、实验结果书写规范，三线表。 可见光分光光度计的操作步骤： 1）预热仪器。 2）选定波长。 3）固定灵敏度档。一般固定在“1”档。 4）调节“0”点。 5）调节T=100％。 6）测定。 7）关机。 （重复2-3次） 表1 BCA法测定蛋白质含量 管号 空白管 1 2 3 4 5 测定管 M （ug） 30 60 90 120 150 ？ 吸光值 仪器型号：721/722型 波长=562nm 思考讨论 1、蛋白质定量分析的多种方法中，哪种方法更适合测定血清蛋白的浓度，说出你的理由？ 2、实验设计及实验操作过程中，有没有可改进的方法，如果有请说出你的想法？ 下次实验：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 预习要点： 1、复习蛋白质两性解离。 2、预习电泳的基本原理。 3、请简要写出操作流程图。 4、请写出计算公式。 一、蛋白质的相关理论知识 16% 蛋白质的平均含氮量 样品中蛋白质的含量= 样品中氮含量 ÷16%（或×6.25） 凯氏定氮法 1、元素组成 2、蛋白质的紫外吸收 280nm 紫外线吸收法 共轭双键 3、蛋白质的呈色反应 双缩脲法 Lowry法 考马斯亮蓝结合法 肽键