小球藻基因工程选择标记研究.doc

小球藻基因工程选择标记研究 王逸云3 , 　王长海 ( 大连理工大学生物工程系, 辽宁大连　116024 ) 摘要: 研究了小球藻对10 种常见抗生素: 庆大霉素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉 素、链霉素、G418、潮霉素、Zeocin 和氯霉素的敏感性, 发现小球藻对庆大霉素、新霉素、氨苄 青霉素、卡那霉素、头孢霉素和链霉素不敏感; 对G418 和潮霉素较敏感; 对Zeocin 和氯霉素最 敏感. 利用统计学的方法和原理, 确定了G418、潮霉素、Zeocin 和氯霉素在海水培养基和淡化 10 倍的培养基中对小球藻的半致死剂量和95% 可信限. 为筛选出小球藻基因工程藻株的选 择试剂, 建立其遗传转化系统奠定了基础. 关键词: 小球藻; 抗生素; 半致死剂量; 选择标记 中图分类号: Q 949. 217 文献标识码: A 0　引　言 海洋藻类是海洋中重要的初级生产者, 其种 类繁多, 数量庞大, 且利用太阳能效率高, 具丰富 营养, 是重要的生物资源. 随着陆地生物资源的 日益匮乏, 开发海洋, 利用海洋, 向海洋要食品、要 药品、要能源已成为人们的共识, 因此海洋藻类, 尤其是经济种类基因工程的研究和开发潜力越来 越受到关注. 近几年来, 海洋大型藻类基因工程 研究已取得了一定的进展[1～ 4 ] , 但对海洋微藻的 转化报道还较少. 小球藻是一种单细胞真核绿 藻, 作为生物反应器可对复杂蛋白进行正确的翻 译后加工, 形成有活性的分子; 同时又具备微生物 的特点, 生长繁殖迅速, 培养条件简单, 生产成本 相对低廉, 易于大规模培养; 对其基因组结构与功 能的研究也日益深入, 因而小球藻是进行基因工 程研究的较理想材料[5 ]. 迄今有关小球藻基因工 程的研究多集中于淡水小球藻[5～ 10 ] , 对于海水小 球藻的相关研究还未见报道. 本实验室选用一种 海水小球藻——Ch lorella sp. MACC?C 95 为实 验材料, 探索用它进行遗传操作的可能性. 建立遗传转化系统中一个关键的环节是确定 　适合的选择标记基因, 以便于把转化体同非转化 体分开. 目前, 真核藻类的选择标记基因研究得 还不太完善. 以往的报道中, 对海带、裙带菜、金 藻、盐藻, 及淡水小球藻的选择标记基因进行了较 系统的研究[5、11～ 16 ]. 但是, 海水生小球藻尚未有 这方面的报道. 因此, 为筛选到海水生小球藻 (Ch lorel la sp. MACC?C 95) 基因工程的选择试 剂, 选择10 种抗生素, 研究小球藻对它们的敏感 性, 并测定抗生素对小球藻的半致死剂量和95% 可信限, 以期为这种海水生小球藻遗传转化系统 的建立提供参考和依据. 1　材料和方法 1. 1　小球藻来源及培养方法 小球藻(Ch lorel la sp. MACC?C 95) 购自中国 海洋大学微藻室. 培养温度(25 ± 0. 5) ℃, 光强 1. 0～ 1. 6mW ? cm 2, 持续光照, 培养液为f?2 培养 基, 所用海水取自大连水产学院近海海域, 并经孔 径0. 22 Lm 的玻璃纤维滤膜过滤除菌. 1. 2　抗生素来源及配制 氯霉素、氨苄青霉素、链霉素、新霉素购自 Sigma 公司; G418、潮霉素、卡那霉素、Zeocin 购自 　收稿日期: 2006204220; 　修回日期: 2007203209. 基金项目: 国家“十五”重点科技攻关课题资助项目(2001BA 707B03). 作者简介: 王逸云3 (19742) , 女, 博士生, E2mail: yanwyy@sina. com; 王长海(19632) , 男, 教授, 博士生导师. 2　结果和分析 2. 1　海水液体培养中小球藻对10 种抗生素的基 础抗性 实验结果如表3 所示, 小球藻对卡那霉素、庆 大霉素、新霉素、氨苄青霉素、头孢霉素、链霉素都 不敏感, 在它们浓度高达500 Lg?m L 的条件下, 培养两周后小球藻依然生长良好, 没有任何死亡 现象; 小球藻对潮霉素、G418 有一定的敏感性, 在 它们浓度为500 Lg?mL 的条件下, 经过两周的培 养, 小球藻的生长受到一定抑制, 一些细胞死亡; 小球藻对氯霉素和Zeocin 非常敏感, 在它们浓度 为100 Lg?m L 时, 小球藻的生长就受到强烈抑 制, 大量细胞死亡. 同时在实验中观察到本藻种 对氯霉素的溶剂—— 乙醇也有一定的敏感性. 如表3 所示, 加入各剂量的氯霉素处理时, 设置加 入相同体积乙醇的空白对照组. 结果表明乙醇在 最低剂量时即对小球藻有一定的抑制作用, 如选 用氯霉素做小球藻的筛选抗生素需考虑这个影响 因素. 3　讨　论 小球藻对氯霉素、G418、潮霉素、Zeoci