测序质量判断和测序常见问题2015.pptVIP

测序质量判断和测序常见问题 DNA测序原理 目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。 Sanger 法测序的原理 Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。 它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 自动化测序 首先，通过对ddNTP进行不同的荧光标记实现在一个泳道实现四种碱基判读。 后来，各公司有改进了电泳方法，将毛细管电泳技术引入了测序仪，大大提高了分辨率。（排除了横向扩散和泳道间的干扰） 影响测序结果的因素 常见问题 反应整体差，杂峰很多，序列完全比不上 序列能比上，但很多地方有“突变”，有“插入”，有“缺失” 测序长度太短了 常见问题的原因