快速点突变的优化方法.pdf

第47卷 增刊2 厦门大学学报(自然科学版) Vo1．47 Sup．2 2008年 l2月 JournalofXiamenUniversity(NamralScience) Dec．2008 快 速 点 突 变 的 优 化 方 法 王荣浩 ，陈瑞川，刘润忠 (厦门大学生命科学学院，福建厦门361005) 摘要~DNA传统的快速点突变方法即“一步突变法”虽然可使DNA产生突变，但效率不高．市场上出售的快速点突变 试剂盒，其突变效率可达80％以上，然而价钱昂贵．本文论述的快速点突变方法，在传统的 “一步突变法”基础上做了改 进，通过对引物突变点5端序列 Tm值的确定，使引物设计变得简单，初学者可轻松完成 DNA的定点突变，而且大大降 低了成本，适用于对大量DNA进行定点突变试验．试验结果表明：这种经过改良的方法突变率为96．22％，可为研究人 员的试验带来便利，是一种值得推广的新方法． 关键词 ：PCR；pfu；Dpnl；酶切分析 中图分类号：Q78 文献标识码 ：A 文章编号：0438-0479(2008)$2-0282-04 在DNA序列上进行定点突变(ske—directedmu— tagenesis)，是研究蛋白质的结构和功能以及蛋 白质之 1 材料与方法 间的相互作用的重要手段 ．目前，最简便的定点突 1．1 材 料 变方法是 “Quikchange”法(快速突变法)，其原理是： 以环状质粒为模板，采用一对完全匹配并引入突变的 pfuDNA 聚合酶购 自美国Prome~ 公司，DNA 引物进行PCR扩增，产物是未 甲基化的完整质粒，因 Maker、去甲基化酶DpnI以及限制性 内切酶EcoRI和 模板质粒是从大肠杆菌提取的已甲基化的质粒，可采 fI均购 自NewEnglandBioLabs，NaeI购 自Takara公 用 ”I酶切方法清除模板，最后产物中仅余新扩增 司，琼脂糖购 自英国OXOID公司．模板质粒为pRK．5一 的已突变质粒．由于该方法采用的是完全匹配的引物， Flag--CDK9、pRK5-Flag-Tat、pR_K5-HA-Tat(含氨苄青 在PCR过程中易形成引物二聚体，致使 PCR扩增效 霉素抗性基因和EcoRI、SalI酶切位点，均为本实验室 率和所得产物阳性率均非常低，因此，使该方法在推广 构建)，菌株E．coliDH5 为本实验室保存，其它试剂 上受到限制，在实际应用过程中，还需配合 Stratagene 均为分析纯． 公司突变试剂盒内配套的XLIO--Gold超敏感受态细 1．2 方 法 菌才能得到足够的菌落 】．而该试剂盒价格昂贵，不 PCR扩增反应 】：反应体系为25 ，其中高保 利于实验室进行大量 DNA突变试验．有文献报道l4 真pfaDNA聚合酶0．5 L，10xpfuPolymeraseBuffer 采用部分重叠引物法，可显著提高扩增产量和阳性率， 2．5 L，2mmol／LdNTP2．5 ，待突变的质粒模板1 但该法的引物设计原则复杂，需有一定经验的人才能 (浓度为 50ng／~L)，10~moVL正向引物和 10 完成引物设计．我们在其基础上进行了一些摸索和改 N~nol／L反向引物各加 1 L，补双蒸水到25 ．PCR 进，让引物突变点5端序列的Tm值为34~(2左右，并 反应条件为：94~(2预变性 3min，94％2