大专生物化学专题一胶原蛋白的提取.ppt

生物化学实用技术 章宇宁 2012.3 胶原蛋白是一种极其重要的结构蛋白，广泛存在于动物的骨、腱、肌鞘、韧带、肌膜、软骨和皮肤中。 占哺乳动物体内蛋白质总量的25%~30%，相当于体重的6% 至少有19种不同的类型 一种白色、不透明、无支链的纤维蛋白质 通常由3 条多肽链组成，每条链都有左手螺旋结构，三条链绕成右手超螺旋。螺旋区段之外的部分常发生各种交联。 每一条链都有若干个典型的氨基酸序列(-Gly-X-Y-) n 。X、Y 均表示任意的氨基酸,X 通常是脯氨酸(Pro) , Y 通常指羟脯氨酸(Hyp ) 胶原蛋白中缺少Cys和Try 制造食品 止血，促进伤口愈合 作为可吸收的支架材料、缝合材料 作为药物载体 局部整形 从胶原蛋白较为丰富的组织（例如皮肤和肌腱）中提取 传统来源：猪牛羊皮 新兴来源：鱼鳞等 问题一：如何从原料中提取蛋白？ 问题二：如何从蛋白中分离胶原蛋白？ 问题三：如何检验得到的蛋白是胶原蛋白？ 前处理 粗分级（粗提） 细分级（分离纯化） 作业一：某一特定蛋白质分离提纯的一般程序是什么？ 破碎组织细胞，使蛋白更好地与外界条件接触 尽量保持蛋白的天然构象和生物活性 注意控制条件 必要时加入蛋白保护剂 可以先将某一细胞组分分离出来 动物材料：除脂肪组织--- 电动捣碎机、匀浆器、 超声波 植物组织：去种皮--- 石英砂、玻璃粉 细菌细胞：超声波震荡、砂研磨、高压、溶菌酶 称取新鲜猪皮100g，用氯仿/乙醇（2:1）溶液对其进行脱脂后切除皮下脂肪，去毛并细切。将用蒸馏水洗涤后的组织小块放入高速组织捣碎机中捣碎成糊状（12000r/min），用含4.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）充分洗涤以去除脂质及血清等成分，低温离心（8000r/min，30min，4OC）。 第一步：将蛋白与材料分开，使其进入溶液中 酸溶 碱溶 盐溶 酶解 注意根据所要提取的蛋白质的性质选择合适的粗分级方法 提取胶原蛋白常使用的溶剂是中性盐溶液(0.15~2mol/L NaCl)或是稀醋酸溶液。前者只适合提取组织中最新合成的胶原以及交联度可以忽略的胶原。 稀酸，例如0.5mol/L醋酸，柠檬酸缓冲液，pH值在2~3之间的盐酸溶液，要比中性盐溶剂更为有效，但仍只能溶解出组织中大约2%的胶原。 利用10%的NaOH溶液共同处理组织48h左右，可以溶解出大部分胶原。与不溶性胶原结合在一起的脂肪被皂化，非螺旋的端肽被切除，胶原纤维瓦解。最终所得胶原的大小和分子质量，取决于处理时间以及碱的浓度。 酶可以将胶原蛋白分子的端肽切除或部分水解，使之易溶于水 提取胶原蛋白常使用的溶剂是中性盐溶液(0.15~2mol/L NaCl)或是稀醋酸溶液。前者只适合提取组织中最新合成的胶原以及交联度可以忽略的胶原。 稀酸，例如0.5mol/L醋酸，柠檬酸缓冲液，pH值在2~3之间的盐酸溶液，要比中性盐溶剂更为有效，但仍只能溶解出组织中大约2%的胶原。 利用10%的NaOH溶液共同处理组织48h左右，可以溶解出大部分胶原。与不溶性胶原结合在一起的脂肪被皂化，非螺旋的端肽被切除，胶原纤维瓦解。最终所得胶原的大小和分子质量，取决于处理时间以及碱的浓度。 酶可以将胶原蛋白分子的端肽切除或部分水解，使之易溶于水 第二步：用简便且处理量大的方法去除无机物等杂质，得到浓缩蛋白质溶液 盐析 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 超滤 如蛋白相互差异较大，也可初步分离目标蛋白