抗补体活性测定法.docVIP

附录Ⅸ K抗补体活性测定法 本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化，测定供试品的抗补体活性。 试剂（1）镁-钙贮备液 取氯化钙1.103g、氯化镁（MgCl2·6H2O）5.083g，加水溶解并稀释至25ml。 （2）巴比妥缓冲液贮备液 取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g，加水800ml溶解。用1mol/L 盐酸溶液调pH值至7.3，加镁-钙贮备液2.5ml，加水稀释至1000ml，用0.22μm膜滤过，4℃保存备用。 （3）明胶巴比妥缓冲液（GVB） 取明胶0.625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。 （4）阿氏液（Alsever’s液） 取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g，加水溶解并稀释至1000ml（pH6.2左右）。根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟（灭菌后，尽快释放蒸汽）。放冷后置4℃冰箱保存备用。 （5）绵羊红细胞 由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，无菌分装，4℃保存一周后方可使用。 （6）溶血素兔抗羊红细胞血清。 （7）豚鼠血清（补体） 取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，-70℃保存，也可冻干保存。豚鼠血清每1ml中的补体总活性应不低于100CH50。 5%羊红细胞悬液制备 取绵羊红细胞适量，用明胶巴比妥缓冲液至少洗3次后，悬浮于适量明胶巴比妥缓冲液中。取0.2ml红细胞悬液，加至2.8ml水中，待红细胞完全溶解后照紫外-可见分光光度法（附录Ⅱ A）在波长541nm处测定吸光度，根据下列公式，将该溶液的吸光度调节至0.62±0.01（每1ml红细胞悬液含红细胞1×109个）。 V f = Vi×A ———— 0.62 式中Vi 为稀释前红细胞悬液体积，ml； A为稀释前红细胞溶解液吸光度； V f为稀释后红细胞悬液体积，ml。 溶血素滴定 按表1稀释溶血素。从1∶75稀释的溶血素开始，1.0ml不同稀释度的溶血素分别与5%羊红细胞悬液1.0ml混合，37℃放置30分钟后，取0.2ml，加明胶巴比妥缓冲液1.10ml，稀释的豚鼠补体溶液（如150倍稀释补体）0.2ml，37℃放置60分钟后，以每分钟2000转离心5分钟，吸取上清液，照紫外-可见分光光度法（附录Ⅱ A）于波长541nm处测定各管吸光度。每个稀释度做2管。同时再做3管未溶血对照管（明胶巴比妥缓冲液1.4ml，加5%羊红细胞悬液0.1ml），3管全溶血管(水1.4ml加5%羊红细胞0.1ml)，同法操作。按下式计算各管溶血率（Y），以Y值为纵坐标，以不同溶血素稀释度为横坐标作图，从而确定敏化羊红细胞所用的溶血素的稀释度。选择增加溶血素的量也不影响Y值的溶血素的稀释度，为每1ml含1个最小溶血单位（即每1ml含1MHU）。最大溶血率应在50%～70%范围，否则试验不成立。 Y =各管吸光度-未溶血对照管吸光度 ______________________________ ×100% 全溶血管吸光度-未溶血对照管吸光度 表1溶血素稀释 溶血素 稀释度 制备 溶血素 稀释度 制备 明胶巴妥 缓冲液/ml 溶血素 明胶巴妥 缓冲液/ml 溶血素 稀释度 ml 稀释度 ml 7.5 0.65 未稀释的 0.1 600 1.00 300 1.0 10 0.90 未稀释的 0.1 800 1.00 400 1.0 75 1.80 7.5 0.2 1200 1.00 600 1.0 100 1.80 10 0.2 1600 1.00 800 1.0 150 1.00 75 1.0 2400 1.00 1200 1.0 200 1.00 100 1.0 3200 1.00 1600 1.0 300 1.00 150 1.0 4800 1.00 2400 1.0 400 1.00 200 1.0 最适敏化的羊红细胞（EA）的制备 量取每1ml含2MHU的溶血素（A）适量，缓慢注入等体积的5%羊红细胞（E）悬液中，37℃放置15分钟后，2～8℃保存，6小时内使用。 滴定豚鼠血清中补体活性用明胶巴比妥缓冲液适当稀释豚鼠血清，然后按表2滴定补体。以补体用量的对数对Y/（1－Y）的对数作直线回归，从而求出直线回归方程的截距（a）、斜率（b）和相关系数（r），补体活性按下式计算 补体活性（CH50/ml）=(1/X)× (补体稀释倍数/5) 式中1/X为a值反对数的倒数。 抗补体活性测定 根据测得的豚鼠血清补体活性，用明胶巴比妥缓冲液稀释成每1ml含100CH