凝胶电泳毛细管液相色谱质谱联用技术探析大肠癌肿瘤及癌旁组织差异蛋白质组.docVIP

凝胶电泳毛细管液相色谱质谱联用技术探析大肠癌肿瘤及癌旁组织差异蛋白质组 　　摘要通过凝胶电泳将大肠癌患者的手术标本组织（肿瘤与癌旁）中的总蛋白按照分子量分成不同的组分，经胶内水解后，利用毛细管液相色谱质谱联用技术对各个组分的多肽混合物进行蛋白质组学分析，共鉴定出29种差异表达的蛋白质，其中肿瘤组织中表达上调的蛋白质19种，如Fibrinogen beta chain，Vimentin，Fibrinogen gamma chain，Histone H2A type 1B/E，Isoform 1 of Periostin，Fibrinogen alpha chain，Histone H3.1，Alphaenolase，Protein disulfideisomerase A3等； 在肿瘤组织中表达下调的有10种蛋白质，如Sarcomeric tropomyosin kappa，Transgelin，Heat shock protein beta1，Talin1，Isoform 2 of Vinculin，Isoform 1 of FilaminC等。通过蛋白质印迹实验对其中的踝蛋白1（Talin1）和烯醇化酶（Alphaenolase）的蛋白质组学鉴定结果进行了验证。生物信息学分析表明在大肠癌组织中表达上调的蛋白多具有胞外分泌的属性，提示这些蛋白很有可能会渗透到机体内的循环系统中，从而在患者血液或者腹水中能够被检测到； 而在大肠癌组织中表达下调的蛋白则多为细胞骨架、胞外基质纤维等的组成成分，这些蛋白的下调常与肿瘤细胞向周围组织的侵袭和转移有密切关系。本研究为大肠癌的早期诊断、大肠癌初筛等方面的研究等提供了基础数据，对进一步深入研究大肠癌发病机制具有重要意义 关键词凝胶电泳毛细管液相色谱质谱； 大肠癌； 蛋白质组； 踝蛋白1； 烯醇化酶1 1引 言 近年来，随着我国人民生活水平的提高和饮食结构的变化， 大肠癌的发病率和死亡率均有逐年上升的趋势[1]，其发病机制相当复杂，受环境中物理、化学、生物学的因素和机体中遗传、内分泌、免疫等因素共同诱发和影响[2，3]。因此，对大肠癌发生发展过程中所涉及的生物大分子尤其是蛋白质进行全面整体的分析成为深入研究其内在复杂机制的一种重要策略。目前，研究者已对多种人类肿瘤组织或细胞系包括大肠癌中开展了蛋白质组学研究，并取得了一系列成果。 Giusti等[4]通过二维（2D）电泳分离结合质谱分析，在大肠癌患者的肠道灌洗液中发现了38种肿瘤相关蛋白； Hammoudi A等[5]通过二维色谱 （2DLC）技术研究小鼠的小肠上皮细胞经APC基因敲除的蛋白质组变化，发现了81个表达升高的蛋白，生物信息学分析显示其中9种蛋白有可能在血液循环系统中被检测到； Yamamoto等[6]利用毛细管液相色谱质谱联用技术分析了甲醛固定石蜡包埋的结直肠病理组织中癌症区域和非癌症区域的蛋白质差异，发现Cyclophilin A， Annexin A2， 和Aldolase等蛋白在癌症区域的表达明显升高。越来越多的证据表明，大肠癌的发生发展涉及到多个癌基因和抑癌基因的改变，表现为多基因、多步骤的协同累积作用。因此，使用具有多种不同维度、不同机理的分离和前处理手段， 尽可能使复杂样品混合物得到有效地分?x，包括在蛋白和多肽两种水平上对复杂组织样品进行全面分析，能够得到更全面深入的样品蛋白的种类和组成分布特征等信息 作为一种高通量的蛋白质研究方法，蛋白组学的研究对象常常是成百上千种蛋白质，以及蛋白质的不同的修饰状态[7，8]。因此，蛋白质组学研究几乎都首先涉及到对蛋白质、多肽的不同程度的分离， 因此需不断完善和发展相关的蛋白质与多肽分离技术[9，10]。相对于传统的二维凝胶电泳技术，目前发展了二维色谱 （2DLC）、二维毛细管电泳 （2DCE）、液相色谱毛细管电泳 （LCCE） 、凝胶电泳毛细管液相色谱（GelCapLC）等新型分离技术。这些技术与质谱联用，能够直接、全面地对复杂样品中蛋白质组进行分析鉴定，其中， 基于凝胶电泳毛细管液相色谱质谱的联用技术已广泛地应用在蛋白质组学的各个领域。该技术首先将蛋白质混合物经凝胶电泳分离，再将分离后的蛋白质条带剪切后分别进行胶内水解，得到肽段混合物再进行毛细管液相色谱分离。这种策略整合了蛋白质水平的分离（凝胶电泳）和多肽水平的分离（毛细管液相色谱）， 分离效率大为提高， 操作相对简单， 已逐渐发展成为复杂蛋白质组样品的主流分离技术[11，12] 本研究通过凝胶电泳毛细管液相色谱质谱联用技术， 对4名大肠癌患者的手术标本组织（肿瘤与癌旁）进行了全面的蛋白质组学分析，鉴定出差异表达的蛋白质，并对蛋白质组学实验结果进行了生物信息学分析。本研究对于大肠癌的病因、发病机制、临床诊