里氏木霉Cel5A基因优化和其在毕赤酵母中的高效表达.PDFVIP

生 物 工 程 学 报 白仁惠 等/里氏木霉Cel5A 基因优化及其在毕赤酵母中的高效表达 1381 Chinese Journal of Biotechnology /cjbcn October 25, 2016, 32(10): 1381−1394 DOI: 10.13345/j.cjb.160017 ©2016 Chin J Biotech, All rights reserved 工业生物技术 Cel5A 1,2 1 1 3 3 1 1 白仁惠 ，张云博 ，王春迪 ，张斐洋 ，张喆 ，孙付保 ，张震宇 1 214122 2 210037 3 473000 , , , . Cel5A . , 2016, 32(10): 1381–1394. Bai RH, Zhang YB, Wang CD, et al. Gene optimization and efficient expression of Trichoderma reesei Cel5A in Pichia pastoris . Chin J Biotech, 2016, 32(10): 1381–1394. 摘 要: 内切纤维素酶 Cel5A 缺乏是限制纤维素酶制剂高效酶解天然纤维素的关键因素。本文尝试构建高效 表达里氏木霉 Cel5A 的毕赤酵母重组菌株以弥补目前Cel5A 的天然分泌不足，通过基因密码子偏好性优化里 氏木霉Cel5A 基因和构建表达载体pPIC9K-eg2 ，并将其电转入毕赤酵母GS115 以构建重组子，利用浓度梯度 平板和摇瓶发酵筛选获得一株高产毕赤酵母Pichia pastoris 菌株GS115-EG Ⅱ。重组酶的酶学性质分析显示， 该酶分子量50 kDa 、最适pH (pH 4.5) 略有降低及最适反应温度为60 ℃，专一性地作用于非结晶纤维素，与 天然里氏木霉 Cel5A 并无明显区别。通过摇瓶发酵的初步优化，该菌摇瓶培养条件：培养温度 28 ℃、起始 pH 5.0 、接种量2% 、每24 h 添加甲醇 1.5% (V/ V) 、每24 h 添加山梨醇4 g/L 及吐温 80 添加4 g/L ，发酵192 h 重组酶酶活达到24.0 U/mL 。进一步上罐 (5 L) 发酵 180 h，该重组酶Cel5A 酶活高达270.9 U/mL ，蛋白含量 达到4.16 g/L 。重组毕赤酵母P. pastoris GS115-EG Ⅱ是一株适合于外源表达Cel5A 的工程菌，该重组酶可替 代天然分泌Cel5A 适用于当前酶基生物炼制模式下木质纤维素基质高效水解中。 : 毕赤酵母GS115-EG Ⅱ，里氏木霉Cel5A 基因，AOX1 启动子，密码子偏好性，发酵优化，CMC 酶活 Received: January 9, 2016; Accepted: March 4, 2016 Supported by: National Natural Science Foundation of China (No., State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology (No. KFKT2013010), China Postdoctoral Science Foundation (No. 2015M571666), Jiangsu Key Lab of Biomass-based Green Fuels and Chemicals (No. JSBGFC14006). Corresponding author: Fubao Sun. Tel/Fax: +8