第三章：香菇种质资源的SRAP分析.doc

第三章：香菇种质资源的SRAP分析 1材料与方法 供试菌株 为本实验室保存菌种,香菇品种名录见第二章表2.1。 1.2.1试管斜面培养基 PDA培养基200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂、1000mL水。 1.2.2液体PDA培养基 PDA培养基200g马铃薯、20g葡萄糖、1000mL水。 1.3 试剂仪器 SRAP引物为上海博亚生物技术有限公司产品,如下图表3.1;MgCl2和脱氧核苷三磷酸(dNTP，2.5mM each)、Taq DNA聚合酶(5U/μl)为TaKaRa产品。 紫外可见分光光度计：Pharmacia Biotech ultrospec?2000 电泳仪：D-YY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂） 凝胶成像系统：TANON-2008 冷冻离心机:Sigma 3K30 PCR扩增仪:Eppendorf AG22331 Hamburg 冷冻离心机:Sigma 3K30 掌型离心机：江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx-100手掌型离心机 表3.1 SRAP引物序列 Table3.1 Nucleotide sequence of Sequence-related Amplified Polymophism 上游引物 Upstream primer 下游引物 Downstream primers 编号 碱基序列 编号 碱基序列 Me1 TGAGTCCAAACCGGATA Em1 GACTGCGTACGAATTAAT Me2 TGAGTCCAAACCGGAGC Em2 GACTGCGTACGAATTTGC Me3 TGAGTCCAAACCGGAAT Em3 TGAGTCCAAACCGGAGC Me4 TGAGTCCAAACCGGAGC Em4 TGAGTCCAAACCGGAGC Me5 TGAGTCCAAACCGGAGC Em5 TGAGTCCAAACCGGAGC Me6 TGAGTCCAAACCGGTAG Em6 GACTGCGTACGAATTGCA Me7 TGAGTCCAAACCGGTTG Em7 GACTGCGTACGAATTATG Me8 TGAGTCCAAACCGGTGT Em8 GACTGCGTACGAATTAGC Me9 TGAGTCCAAACCGGAGC Em8 TGAGTCCAAACCGGAGC Em9 GACTGCGTACGAATTACG Em10 GACTGCGTACGAATTTAG Em11 GACTGCGTACGAATTTCG Em12 GACTGCGTACGAATTGTC Em13 GACTGCGTACGAATTGGT Em14 GACTGCGTACGAATTCAG Em15 GACTGCGTACGAATTCTG Em16 GACTGCGTACGAATTCGG Em17 GACTGCGTACGAATTCCA 1.4 菌丝培养 将40个香菇冰箱保种菌种接于试管斜面培养基，转管活化7－10天，用接种耙耙碎后，接入250ml三角瓶液体培养基中，每个菌株各接3瓶，于25℃摇床上120 rpm培养10天，用400目铜网过滤，蒸馏水冲洗，滤纸吸干，保存于－20℃备用。 1.5 DNA提取方法 同第二章1.5.2 CTAB法 1.6 香菇基因组DNA电泳检测 取5μlDNA加1 μl 6×溴酚蓝，在0.8％琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mlEB）上电泳，4V/cm电压电泳约1.5h，在凝胶成像仪上照相。 1.7 香菇基因组SRAP-PCR扩增条件优化 SRAP分析在香菇上的应用还没有看见过报道, 为探索出适于香菇SRAP扩增反应的最优体系,比较DNA模板、dNTP,随机引物浓度以及Taq酶用量对RAPD扩增的影响，寻找最优化条件。 对扩增反应25μL体系的各因子设置了如下梯度：模板DNA用量设置10、15、20、25、30、35、40 、45、50ng共9个梯度；随机引物设置2.5μmol/L，5μmol/L，7.5μmol/L,10μmol/L，12.5μmol/L，15μmol/L，17.5μmol/L,20μmol/L共8个梯度；dNTP浓度设50μmol/L，100μmol/L，150μmol/L，200μmol/L，250μmol/L，300μmol/L共6个梯度；Mg2+浓度设置1.5mmol，2.0mmol，2.5mmol，3.0mmol，3.5mmol，4.0mmol共6个梯度；TaqDNA聚合酶设置0.5U，1.0U，1.5U，2.0U，2.5U，3.0U共6个梯度。 扩增反应体系包括1μL模板,2.5μL10×buffer缓液，2.5mLMg2+(25mmol/L)，2.5μLdN