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微生物检测技术 2014.11 微生物的定义和分布 定义： 一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。 分布： 微生物的分布非常广泛，空气、土 壤、水体、动植物等均能找到。 微生物的分类 原核类：细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、 衣原体、立克次氏体、螺旋体 微生物 真核类：真菌(酵母菌、霉菌）、原生动物、 显微藻类 非细胞类：病毒、亚病毒(类病毒、朊病毒) 细 菌 形 态 特 征 细菌细胞形态显微镜检照片 放大1000倍杆菌 放大1000倍球菌 微生物的五大共性 1、体积小，面积大； 2、吸收多，转化快； 3、生产旺，繁殖快； 4、适应强，易变异； 5、分布广，种类多。 细菌结构 细菌的基本结构由细胞壁、细胞膜、细胞浆和细胞核组成。 G+和G- 革兰氏阳性菌：球菌（葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌等）、杆菌（炭疽杆菌、破伤风杆菌、结核杆菌、麻风杆菌等） 革兰氏阴性菌：球菌（脑膜炎双球菌、卡他双球菌等）、杆菌（肠道杆菌等）、弧菌（霍乱弧菌等） 污染微生物的来源 无菌/微生物限度检查理念 微生物实验室保障系统 实验室的建设： 药品检验用微生物实验室的建设方面目前缺乏系统研究，不能简单照搬工厂GMP车间的建设要求或其他行业要求，应在满足GLP要求的原则下，结合药品微生物检验任务的需要合理规划。 实验室管理规范： 一个实验室达标与否，以及是否正常运行，更主要地依赖于严格的管理规范，这不仅是保证检验质量的要求，也是目前实验室认证认可的主要要求。 标准化研究与发展 人、机、物料和环境 实验室的建设（硬件） 洁净实验条件 有效性：整体10000级、局部100级。 安全性：保护样品、人员和环境。 可操作性：方便、快捷、顺畅。 洁净实验条件的维护、验证 阳性菌实验室达到P2生物安全标准 试验环境的要求及无菌操作 环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的 单向流空气区域内进行。 阳性实验室、无菌检查间、限度检查间分离。 严格按无菌操作,防止实验室的培养物被其他外来微生物污染；避免操作者自身被微生物感染。 无菌操作在有洁净级别的实验室中进行，与试验相关的金属器械、玻璃器皿、稀释剂等应经过灭菌处理；其他的材料应经过表面消毒、紫外线照射消毒后，再带入实验室 。 培 养 基 的 基 础 知 识 培 养 基 的 基 础 知 识 培 养 基 的 基 础 知 识 培养基 培养基的制备 培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2~25℃、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。 培养基种类（无菌检查用） .硫乙醇酸盐流体培养基(用于培养好氧菌、厌气菌) 改良马丁培养基（用于培养真菌） 培养基适用性检查 无菌检查 每批培养基随机不少于5支（瓶），培养14天，应无菌生长。 本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。 灵敏度检查 菌种 ：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。 微生物的生长（population growth）与代时（generation time） 不同微生物的代时范围是20min~10h 大肠埃希菌：20min 枯草芽孢杆菌：28min 金黄色葡萄球菌：30min 铜绿假单胞菌：35min 大肠埃希菌20min繁殖一代，繁殖13h后，其子代细胞数可以达到1 × 1013个（约等于人体全部细胞数），培养24h后子代细胞数则可以达到4.7 × 1021个 灵敏度检查 菌液制备：接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤获营养琼脂培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35℃培养18~24小时；接种白色念株菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁培养基中，23~28 ℃培养2