荧光光谱分析法-课件.ppt

2008年诺贝尔化学奖 green-fluorescent protein (GFP) 电子能级的多重性 M=2S+1 激发态→基态的能量传递途径√ 激发光谱与发射光谱的关系√ 二、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure 2.有机化合物的分子结构与荧光的关系√ √三、影响荧光强度的因素 relation between fluorescence and molecular structure 4.内滤光作用和自吸现象 5.荧光熄灭剂 第二节 荧光定量分析方法 一、荧光强度与物质浓度的关系 I0 I F (荧光定量分析法的依据) 结论：荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀的溶液(A<0.05)。对于较浓溶液，会产生自熄灭现象。 二、定量分析方法 优点 1.灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.001?g/mL 2.选择性强 既可依据发射光谱特征，又可根据激发光谱特征； 3.试样量少和方法简单 缺点 应用范围小 1.校正曲线法 C F 校正曲线 CX FX 步骤： 1.配制不同浓度的标准 溶液 2.做F～C关系曲线 3.求得浓度 注意：固定仪器和测定条件； 试样浓度在线性范围内 2.比例法 注意：样品与标样溶液浓度接近，在线性范围内 步骤： 1.配制标准溶液和试样溶液 2.测F 3.求浓度 3.联立方程式法 两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定 分别在各自的?荧波长处测定,求出它们的含量 两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有显著区 别,在某一激发光下一个组分产生荧光峰,另一组分不产生荧光;选用不同的激发光进行测定 如果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰 利用荧光强度的加和性（F=F1+F2+F3+ ），在适宜的荧光波长处测定，用联立方程来求解 第三节 荧光分光光度计和其他荧光分析技术 用于测量荧光强度的仪器有： 1.滤光片荧光计 2.滤光片－单色器荧光计 3.荧光分光光度计 一、荧光分光光度计 1.荧光分光光度计的主要部件：光源、激发单色器、发射单色器、样品池、检测系统 光源 激发单色器 样品池 发射单色器 检测器 放大器 指示器· 记录器 SK-2003A型荧光光谱仪(国内首创） RF-5400荧光光度计 Hitachi(日立)F-2500荧光分光光度 荧光分光光度计澳大利亚 2.仪器的校正 灵敏度的校正 在选定波长及狭缝宽度的条件下，用一种稳定的荧光物质，配成浓度一致的对照品对仪器进行校正，使每次测得的荧光强度调节到相同数值（50％或100％）。 波长校正 汞灯的标准谱线对单色器波长刻度校正。 激发光谱和荧光光谱的校正 1.单光束荧光光度计，可用仪器上附有的校正装置将每一波长的光源强度调整到一致，然后以表观光谱上每一波长的强度除以检测器对每一波长的感应强度进行校正。 2.双光束荧光光度计，可用参比光束抵消光学误差。 二、其他荧光分析技术简介 1.激光荧光分析 特点：激光作光源，一个单色器，用于分析超低浓度物质。 2.时间分辨荧光分析 特点：利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检测之间延缓的时间不同，实现分别检测的目的。 3.同步荧光分析 特点:选择适宜的?λ,同时扫描激发波长和发射波长，得到同步荧光光谱；减少光谱重叠，提高分辨率；用于定量分析。 4.胶束增敏荧光分析 特点：采用化学方法提高荧光效率；胶束溶液对荧光物质有增溶、增敏和增稳的作用。 6、散射光 小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。 瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。 拉曼光：√光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而发射出比入射光稍长或稍短的光。 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取措施消除。拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发光波长 选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰 a:320nm或350nm为激发光，荧光峰总是在448nm。 b:将空白溶剂分别在320nm及350nm激发光照射下测定荧光，激发光波长为320nm时，拉曼光波长是360nm，360nm的拉曼光对荧光无影响；当激发光波长为350nm时，拉曼光波长是400nm，400nm的拉曼光对荧光有干扰，因而影响测定结果。 ?硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱 四、