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《分子生物学》教案 E DNA 复制 教学目的和要求 1 理解DNA复制的半保留机制和半不连续复制 2 掌握细菌DNA复制过程及有重要作用的酶和蛋白质 3了解细胞周期 4 了解真核生物DNA复制的特点 E1 DNA复制概述 半保留机制 DNA两条亲代链分别作为模板催化新生子链的合成，新生DNA的一条链是原来的旧链，另一条是新合成的，为半保留复制。Meselson 和 Stahl (1958年)用实验证明了该机制（见教材P71）。亲代链分开及新生DNA开始复制处称为复制叉。DNA合成的底物是脱氧核苷三磷酸（dNTP ）:dATP dGTP 、 dCTP 、 dTTP 。合成的能量来自 dNTP的水解。 复制子、复制起始与终点 以单一单位复制的任一段DNA都称为复制子。每个复制子都有固定的起始点，原核生物许多病毒的DNA 呈环形，为单一复制子，通常两个复制叉从一个起始点向两个方向复制，复制的起始和细胞生长周期调节都在起始点处调节。真核生物的线性染色体由多复制子构成，每个复制子都有自己的起始点，起始点在最初解链处富含AT序列，它比富含GC的起始点更易解链。 半不连续复制 由于DNA新链合成只允许以5/→3/ 方向 进行，而两条亲本链反向平行，因而一条新链从起始点按 5/→3/ 方向连续合成（前导链），另一条新链（后随链）从复制叉开始按 5/→3/ 方向先合成一些短的DNA片段（冈崎片段），再由连接酶连成一条连续的DNA。即前导链连续合成为长链，后随链则是间断合成的，这种合成方式为半不连续复制。 RNA引导 在每一片段的5/ 端先合成一小段RNA（引物），引导DNA合成。 E2 细菌的DNA复制 起始 E.coli的起始点位于遗传基因座 oriC，大肠杆菌编码的蛋白 DnaA首先识别和结合于 oriC的9bp重复序列形成复合物，约45bp成为单链， DnaB进入，它是DNA解旋酶，利用ATP水解产生的能量解开双链DNA，形成的单链泡被单链结合蛋白 Ssb所覆盖。DNA引发酶结合到DNA上并合成引物RNA。 解旋 DNA解旋酶沿模板链前进，打开双螺旋使复制顺利进行，在闭环DNA中复制叉处解旋所形成的正超螺旋可通过Ⅱ型拓扑异构酶即DNA旋转酶的作用而释放。 延伸 DNA聚合酶Ⅲ的全酶二聚体引发体和DNA解旋酶结合成复合体（复制体），以每秒900bp的速率合成DNA。引发体含有 DnaB解旋酶和DNA引物酶，在后续链上间断合成RNA引物。 DNA聚合酶Ⅲ催化合成DNA，该酶含有聚合酶α亚基和一个3/ →5/外切核酸酶ε亚基。DNA聚合酶Ⅰ负责切除引物并填补缺口，该酶具有5/ → 3/ 聚合酶、5/ → 3/ 外切核酸酶及3/ →5/校正外切核酸酶活性。DNA连接酶填补片段间的缺口。 终止与分离 两个复制叉在 oriC约1800的对面相遇。该区域有终止子位点，它们与 DnaB抑制剂（tus基因的产物）结合，阻止复制叉移动。复制结束后两个相扣的子链DNA由拓扑异构酶Ⅳ（一种Ⅱ型拓扑异构酶）解联，分配到两个子细胞。 E3 细胞周期 细胞周期 细胞分裂为两个子细胞的全部过程为细胞周期，它包括DNA的复制和细胞分裂。细胞周期分4个时期：G1期—细胞为复制作准备；S期—DNA复制；G2期—S期后有丝分裂前的短暂期；有丝分裂期—染色体对等分配到两个子细胞，它又有前、中、后期之分。G1 、S、G2 共同组成间期。有丝分裂后，增殖的细胞进入下一个细胞周期的G1期，也可脱离细胞周期进入非增殖的休眠状态G0期（沉默期）。 检验点及其调控 在G1期有决定细胞进入下一个分裂周期的限制点（R点），细胞分裂周期起始还需促细胞分裂原，若细胞在到达R点之前缺乏促细胞分裂原，细胞将重进G0期。细胞周期中终止细胞分裂的那些点叫检验点，它在间歇期发生以保证细胞分裂之前完成DNA复制。 细胞周期蛋白和CDK 蛋白磷酸化是调控细胞周期进程的一个主要机制，由一个调节亚基（细胞周期蛋白）和依赖细胞周期蛋白的激酶（CDK）来完成，细胞周期蛋白—CDK复合物决定将被磷酸化的目标蛋白。 E2F和RB的调控 由G1期进入S期主要依靠对E2F这一转录因子的激活，E2F的活性又受与其结合的蛋白RB的抑制，在G1中后期，细胞周期蛋白—CDK复合物使RB磷酸化从而释放E2F进而激活转录。 细胞周期的激活、抑制和癌症 小的抑制蛋白如CIP蛋白和INK4蛋白可通过抑制细胞周期蛋白—CDK复合物的活性来延迟细胞周期的进程。 细胞周期与癌症间有着根本的联系，G1到S期的过渡受到原癌基因和抑癌蛋白的调控。B细胞的癌变与细胞周期蛋白D1基因的过表达相关。人类癌症中两个重要的抑癌基因产物—抑癌蛋白RB和P53均与细胞周期调控