生物技术概论第四章酶与细胞的固定化.pptVIP

Enzyme Engineering酶工程 第四章 酶与细胞的固定化 固定化技术发展 （游离）酶应用的一些不足之处： （1）酶的稳定性较差，易受外界（溶液） 条件影响而活性降低或失去活性； （2）产物的分离纯化较困难； （3）酶使用后通常不能回收，即一般只是 一次性使用。 改善方法之一就是固定化技术的应用: (1)固定化酶: 是指固定在一定载体上并在一定 的空间范围内进行催化反应的酶。 (2)固定化细胞: 是指固定在载体上并在一定的空 间范围内进行生命活动的细胞。 (3) 固定化原生质体技术: 有利于胞内物质的分泌。 第一节 酶的固定化 第二节 微生物、植物细胞和动物细胞固定化 第三节 原生质体固定化 第一节 酶的固定化 一、固定化酶的优缺点 二、酶的固定化方法 三、固定化酶的性质 四、固定化酶的应用 一、固定化酶的优缺点 1、固定化酶的优点 ： ① 稳定性较天然酶高； ② 反应后酶易于和底物及产物分开，可在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化； ③ 反应液中无残留酶，产物易于纯化，产物得率提高，利于提高产品质量； ④ 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化控制； ⑤ 较能适应于多酶反应体系。 2、固定化酶的缺点： ① 酶固定化时酶的活力有所损失，尤其是需经提纯后才被固定化的酶； ② 酶固定化过程中所用载体及试剂较贵，增加了固定化的成本，使工厂开始投资大； ③ 比较适应水溶性底物和小分子底物，大分子底物常受载体阻碍，不易与酶接触，限制了酶催化作用的发挥。 二、酶的固定化方法 1、吸附法 2、包埋法 3、共价偶联法 4、交联法 1、吸附法： ◆利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。 ◆物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。 ◆靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。 2、包埋法 ◆将酶分子包埋于凝胶网格或半透性的聚合膜腔中的酶固定化技术称为包埋法。 ◆包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。 ◆包埋法制备固定化酶或固定化菌体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和微囊包埋法两大类。 ◇凝胶包埋法：是将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。多数为球状或片状。 常用凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。 ◇微囊包埋法：是将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。 常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。 微胶囊的制备方法有界面沉降法、界面聚合法、液体干燥法、脂质体包埋等。 热处理法 ◆将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。 ◆热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。 3、共价偶联法 ◆共价键偶联法是酶分子的活性基团与载体表面功能基团之间经化学反应形成共价键而偶联在一起的一种酶固定化方法。 （1）酶分子上的活性基团 （2）载体 （3）偶联方法 ◇ （1）酶分子上的活性基团 酶分子上含有多种化学基团，能进行共价结合的活性基团主要有氨基、羧基、苯环结构、羟基、咪唑基、巯基等。 ◇ （2）载体 分为初始载体和活化载体。 初始载体主要有硅胶、纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、甲基丙烯醇共聚物、氨基酸共聚物以及甲壳质等。 ◇要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。 ◇使载体活化的方法很多。主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等。 ◇ （3）偶联方法 按不同的偶联反应方式，可分成重氮法、多肽法、烷化法、缩合法等。 4、交联法 ◆交联法是利用双功能或多功能试剂（交联试剂）在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，形成共价键连接来制备固定化酶的方法 。 交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 ◆常用的交联试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。 最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶