分子实验--WesternBlotting检测人IgG.docVIP

Western Blotting检测人IgG 作者 兰州大学生命学院 生物学基地班 摘要 本实验采用人血清为材料，对此样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用电转移法将蛋白质转印到硝酸纤维素薄膜上，用兔抗人IgG为第一抗体，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为第二抗体，在过氧化物酶底物存在的情况下，检测人的IgG。 关键词 Western Blotting 抗体 电泳 前言 Western Blotting是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质为抗原，与对应的第一抗体发生免疫结合反应，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异目的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测目的蛋白质的表达水平。 正文 一、实验试剂，器材和材料的准备 试剂 （1）药品：丙烯酰胺 N,N—甲叉双丙烯酰胺，四甲基乙二胺，过硫酸铵，三羟甲基氨基甲烷（Tris），甘氨酸，琼脂，蔗糖，溴酚蓝，十二烷基硫酸钠，甲醇，甘油，巯基乙醇，考马斯亮蓝R-250标准分子量蛋白，冰乙醇，兔抗人IgG，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，脱脂奶粉，HCL，NaCL，过氧化氢，CoCl2. 电极缓冲液：甘氨酸28.2g，SDS1g，Tris6g,加水至1000ml，ph8.3.用时稀释一倍。 转移缓冲液：25mmol/lTris,192mmol/l甘氨酸，20%甲醇，ph8.3 TBS缓冲液：20mmol/LTris-HCl,500mmol/LNaCl,ph7.5 TTBS:取100mlTBS,加50ul Tween-20 封闭液及抗体稀释液：3%脱脂奶粉-TBS 底物溶液：2.5mg二氨基联苯胺+9mlTBS+1ml0.3%CoCl2+10ulH2O2,临用前配置。 30%丙烯酰胺贮备液:29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水至100ml。 浓缩胶缓冲液：0.5ml/l Tris-HCl，ph6.8 分离胶缓冲液：3mol/LTris-HCl,ph8.9 10%过硫酸铵：临用前配置 10%SDS 10%TEMED 1%琼脂 2x样品缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，ph6.8,20%甘油，4%SDS，10%巯基乙醇，0.005%溴酚蓝。 低分子量标准蛋白：加200ul重蒸水溶解，再加200ul2x样品缓冲液，沸水浴加热五分钟，离心后取上清液作为标准样品。 考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-250 0.25g，50%甲醇454ml，冰乙酸46ml，总体积500ml。 脱色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。 保存液：3%乙酸。 器材：夹心式电泳槽，转移电泳槽，电泳仪，凝胶成像分析系统 实验材料：人血清，硝酸纤维素薄膜 二、实验过程 1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 灌胶前的准备：取两块玻璃板洗净晾干，嵌入橡胶带的凹槽中，一块略长一点的玻璃板下沿与橡胶带框底部之间留有2-3mm空隙，以便凝胶的一侧与电泳槽电极液相通；另一块短玻璃板的下沿嵌入橡胶框底部，两块玻璃板之间形成一个“空腔”，然后将嵌有玻璃的橡胶凹槽装入电泳槽之间，用固定螺丝固定，在长玻璃板一侧的底部用1%琼脂密封。 凝胶的配置 分离胶 浓缩胶 12 4 30%贮备液/ml 3.2 0.53 分离胶缓冲液/ml 2 --- 浓缩胶缓冲液/ml ---- 1.0 重蒸水/ml 2.66 2.36 10%SDS/ul 80 40 抽气十五分钟后再加入下列试剂 10%TEMED/ml 0.08 0.04 10%过硫酸铵/ml 0.04 0.02 总体积/ml 8 4.0 灌胶：将配置的分离胶加入到橡胶框的“玻璃腔”内，待胶液加至距短玻璃板顶端3cm处时停止灌胶，然后再胶液表面上小心加入厚约0.5cm的水层，以保持分离胶面平整。待凝胶和水之间界面清晰时，说明胶已经聚合。聚合好的分离胶，倾去上层水，插上加样梳，将配置好的浓缩胶液加到分离胶上，直至短玻璃板的顶端。放置30-60分钟待其聚合。 加样：拔出加样梳，用电极缓冲液冲洗样品槽后加样。 电泳：调节电压至150v电泳。电泳完成后取出胶，切出2条点有样品的胶条，一条含人血清样品和分子量标准蛋白，用考马斯蓝R250染色液染色，1h后，换成脱色液脱色，中间换1-2次脱色液至蛋白质条带清晰，再换至3%乙醇中保存；另一仅含人血清样品的胶条用于转印和酶联免疫染色。 2.转印蛋白质到硝酸纤维素薄膜上 3.膜的酶联免疫染色 4.对胶和膜上的显色结果照相 5.实验结果： 胶： 全长 a1 a2 a3 a4 a5 a6 a7 8.28cm 0.77cm 1.49cm