蛋白质工程 3蛋白质的修饰和表达.pptVIP

第三章 蛋白质的修饰和表达 第一节 蛋白质修饰的化学途径 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 第三节 重组蛋白质的表达 第一节 蛋白质的化学修饰 凡通过活性基团的引入或去除，而是蛋白质一级结构发生改变的过程 影响因素： 1) 蛋白质功能基的反应活性 基团之间的氢键和静电作用 基团之间的空间阻力 2) 修饰剂的反应活性 根据化学修饰剂与蛋白质之间反应的性质不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质的巯基、氨基和羧基等侧链基团进行修饰 蛋白质化学修饰的主要部位是蛋白质的侧链基团，通过选择性试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的 1）碘乙酸和碘乙酰胺 2）N-乙基马来酰亚胺：反应伴随光吸收的变化 1）三硝基苯磺酸：与赖氨酸残基的ε-氨基发生反应形成氨基磺酸复合物 二硫键的化学修饰 二硫键的还原：必须使用超剂量的巯基乙醇，同时用过羧甲基化处理 判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS电泳技术 专一性： 试剂对被修饰基团的专一性 对蛋白质分子中被修饰部位的专一性 同时具有对被作用基团和被作用部位的专一性的化学修饰，成为亲和标记或专一性的不可逆抑制作用，也称为位点专一性抑制剂 1) 亲和标记 Ks型的不可逆抑制剂 Kcat型的不可逆抑制剂 光亲和标记 还具有光反应基团 聚乙二醇(PEG) 由环氧乙烷聚合而成，平均分子量由几百到几万的聚合物，分子两端各有一个羟基。具有良好的水溶性，也能溶于二氯甲烷、苯、乙腈和乙醇等有机溶剂 PEG末端的羟基是其化学反应的功能基团，但必须在较剧烈的条件下才能与其它基团发生反应。为使蛋白质能在温和条件下，以较高的速率与PEG偶联，需先对PEG进行活化 交联剂为含有双功能基团的化学试剂 化学交联可以发生于分子内的亚基与亚基之间，也可以发生于蛋白质分子与分子之间，也可发生于多个分子之间，而形成网状交联。 化学偶联：将蛋白质分子偶联到一个惰性的水不溶性的载体上，形成固定化蛋白质 化学修饰影响的条件 1、温和的反应条件是防止蛋白质分子变性的一个必要条件 2、pH值得变化：决定了具有潜在反应能力的基团所处的可反应和不可反应的离子状态。 3、温度：影响活性巯基的微环境 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，但有机溶剂可使蛋白质变性。 第二节 蛋白质的分子生物学改造 一、基因突变 1.??????? 定点突变 2.??????? 定向进化? 二、基因融合 1.??????? 利用基因融合技术表达外源基因的缘由 2.??????? 基因融合的策略 3.??????? 产生蛋白质分子嵌合体的方法 4.??????? 蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接 ?三、搀入非天然氨基酸 一、基因突变技术 定点突变 1) 重叠延伸PCR技术 2) 快速定点突变 2. 定向进化 1) 制造突变体：易错PCR、DNA改组 2) 筛选：表型观察和筛选，高通量筛选方法 重叠延伸PCR技术 快速定点突变 二、基因融合 基本原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白或多肽基因，即可实现两个基因的融合表达，融合蛋白具有衍生因子的双重活性 基因融合的用途 上述这些基因融合策略，主要是有利于外源基因的表达、表达产物的分离、纯化以及细胞定位。作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。 tRNA接到的非天然氨基酸掺入 4.1将目标蛋白质的基因重组入可用于体外转录的载体中 4.2 利用寡核苷酸介导的位点特异性突变，将特定氨基酸的密码子突变为无义密码（TAG） 4.3 利用run off转录或化学/酶法反密码子环取代法合成相应的校正tRNA，将氨基酸连接在校正tRNA上 4.4 通过体外转录体系，产生在特定位点突变成UAG的mRNA， 4.5 通过体外反以体系，将非天然氨基酸掺入到蛋白质分子中的特定位点 第三节 重组蛋白质的表达 一、大肠杆菌中表达体系的优点 大肠杆菌(