RBX诱骨活性成分的分离与纯化论文.docVIP

　　RBX诱骨活性成分的分离与纯化论文 .freelg高度纯化的蛋白质，组织学观察其活性发现植入小鼠股部第10日.freelaterial，re-constituted bone xenograft have gained much success in the repair of bone defect and bone nonunion.To study relative molecular mass of osteoinduction protein in reconstituted bone xenograft.METHODS Using heparin sepharose Cl-6B chromatography，the osteoinduction protein in reconstituted bone xenograft（bone morphogeic protein，BMP） purification plantation into the thigh muscles of mouse.Using sodium dodecyl sulfate-polyacry-lamide gel electrophoresis（SDS），the molecular mass of purified protein could be knog，and in vivo by the end of10th day，much more chondrocytes and cartilage matrix form and trabeculae can al-so been seen.From SDS，highly purified protein is homodiner protein olecular mass of35×103 ，and22×103 on reduction.CONCLUSION The35×103 protein in reconstituted bone xenograft ol L-1 脲/0.5mol L-1 GaCl/1mmol L-1 NEMI）24h，提取上清，经透析、离心后得到粗制BMP，将其复溶于纯化液（4mol L-1 盐酸胍/0.5mol L-1 GaCl/1mmol L-1 NEMI），上清再经透析、离心后得到了部分纯化的BMP.在0.08MPa负压下将其与牛松质骨载体（本校西京医院自制）按1∶5质量比复合，蒸馏水透析72h，冻干. 1.2 肝素亲和层析纯化 取160mg部分纯化的蛋白复溶于10mL的平衡缓冲液中（Buffer A:6mol L-1 脲/50mmol L-1 Tris.HCl/0.1mol L-1 NaCl pH7.0），以20000g的速度离心30min，除去其中不溶的物质.用上清对160mm×10mm的肝素亲和层析柱加样（注意不要破坏凝胶表面）.层析柱分别按次序用以下三种缓冲液洗脱，即含有0.1，0.15，0.5mol L-1 NaCl的Buffer A溶液，分别收集洗脱下来的蛋白质，经透析、离心、冻干后保存，测质量. 1.3 生物活性检测 选用雄性BALB/c小鼠（第四军医大学实验动物中心供给）10只，体质量（20±2）g，随机分成2组，每组5只.将冻干后的蛋白分别植入小鼠右侧股部肌袋中，其中A组植入0.4mg纯化后的蛋白质，B组同时植入牛血清白蛋白作为对照.在术后第10日全部处死，取出植入物周围2cm的软组织.标本均经组织学常规处理，切片行HE染色，镜下观察异位成骨的情况. 1.4 蛋白相对分子质量的测定 采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，它多用于蛋白质及核酸的Mr 测定.将纯化后的蛋白质溶于含有二硫苏糖醇（DTT）或不含有DTT的样品缓冲液中，90℃加热3～5min，离心后用上清加样.电泳凝胶为50mL L-1 的积层胶、125mL L-1 的分离胶.电泳完毕后，用考马斯亮蓝R-250染色，再测其相对分子质量. 2 结果 将部分纯化的蛋白质加入层析柱后，洗脱液以120cm h-1 的速度洗脱（Fig1所示）.用Buffer A洗脱时，未吸附的蛋白质基本都流出;改用Buffer B液（含有0.15mol L-1 NaCl），洗脱吸附较弱的蛋白，从Fig1可见此时pH值下降，离子浓度增加，且有较大量的杂蛋白流出，称为B峰;用含有0.5mol L-1 NaCl的Buffer C液洗脱时，获得C峰，此峰为我们主要收集的目的蛋白.A段蛋白与肝素亲和层析无亲和力，故弃去不用，将B峰、C峰收集的蛋白对四蒸水进行透析约24h，其间换液3次.透析发现，C峰蛋白有白色絮状沉积，表明不溶于水;而B峰蛋白透析液仍澄清透明，均溶