SMART 技术构建肾乳头状腺癌及癌旁组织的cDNA文库论文.docVIP

　　SMART 技术构建肾乳头状腺癌及癌旁组织的cDNA文库论文 成瑜 李旭 陈葳 杨玉琮 【关键词】 肾肿瘤 Construction of cDNA libraries of renal papillary adenocarcinoma tissue and its side tissue a tissue and its side tissue by SMART technology. METHODS: Sechanism at 5′end of mRNA template technology, SMART technology, plate, Poplate RNA to enrich the fulllength cDNAs. After amplification, the ds cDNA ns (CHROMA SPIN400) and then rebined to the λTripIEx2 vector. After package, the libraries ined and then the cDNA libraries plified. RESULTS: The titer of the cDNA libraries of renal papillary adenocarcinoma tissue and its side tissue L-1 and 2.6×106 pfu mL-1, respectively. After amplification, the rates increased to 6×1011 pfu mL-1 and 9×1011 pfu mL-1, respectively. CONCLUSION: Our successfully constructed cDNA libraries are fulllength libraries a. 【Keys; cDNA library; SMART 【摘要】 目的： 运用SMART 技术构建肾乳头状腺癌及癌旁组织的cDNA文库. 方法： 运用mRNA 5′末端的模板转换方法，即SMART技术，以纯化的Poly(A)+RNA为模板，用PoRNA 的5′末端添加一段5′ oligo作为延伸后的模板，从而富集全长 cDNA. cDNA扩增后， 经sfiI酶切、CHROMA SPIN400洗脱，与λTripIEx2载体连接并用载体蛋白包装后.freelL-1和2.6×106 pfu mL-1，重组率均 98%，扩增后滴度分别达6×1011 pfu mL-1和9×1011 pfu mL-1. 结论： 我们构建的人肾乳头状腺癌及癌旁组织cDNA文库为高效、全长cDNA文库，可以用做探针、抗体等免疫学筛选, 进一步探寻与肾乳头状腺癌相关的基因. 【关键词】 肾肿瘤；cDNA文库;SMART技术 0引言 肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，生物学行为极为多变，其发病机制及发生发展的分子生物学基础至今不明. 鉴于此，我们利用SMART(sechanism at 5′end of mRNA template)技术分别构建了肾乳头状腺癌及其癌旁组织的cDNA文库，为肾乳头状腺癌相关基因的研究工作奠定了基础. 1材料和方法 1.1材料人肾乳头状腺癌和癌旁正常组织(距癌组织1.5 cm以上)由西安交通大学第一医院泌尿外科提供. TRIzol试剂购自Gibco公司; SMARTTM cDNA library construction kit购自Clontech公司; OligotexTMdT30 mRNA purification kit购自Takara株式会社; 载体包装蛋白为Epicentre产品; IPTG, XGal购于Promega公司，其余均为国产分析纯. 1.2方法 1.2.1总RNA提取及mRNA纯化人肾乳头状腺癌和癌旁组织各0.5 g入预冷的匀浆器中，随即加入TRIzol 5 mL，于冰浴中研磨成匀浆，氯仿异丙醇抽提，750 mL L-1乙醇洗涤干燥后溶于200 μL无RNase水中［1］. mRNA提取按照OligotexTMdT30 mRNA purification kit操作说明书进行. 1.2.2cDNA文库的构建取1.0~1.5 μg Poly(A)+RNA，以5′oligo(5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG3′)及3′oligo(dT)［5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30 N’N3’,.freelin, 95℃ 20 s, 随后进行循环: 95℃ 5 s，68℃ 8 min，其中肾乳头状腺癌进行4个循环，癌旁组织进行