第十一章 DN文库构建和目基因筛选2.ppt

第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选;本章提要;本章要求;基因库(gene pool)：特定生物体全基因组的集合(天然存在) 。 基因文库(gene library)：指某一生物体全部或部分基因的集合 。某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。根据外源DNA片段来源的不同，基因文库分为：;基因组文库：分离特定的基因、分析特定基因的结构、研究基因的起源与进化、基因的表达调控 cDNA文库：大规模基因测序、发现和寻找新基因、基因注释、基因表达谱分析、基因功能研究;DNA文库构建的基本程序;第一节 ?基因组 DNA 文库的构建;根据构建文库载体的不同，分为： 1、质粒文库：容纳片段小于10kb，以菌落的形式保存和筛选，一般用于对大片段文库的亚克隆，用于鸟枪法测序等。 2、噬菌体文库：一般用λ载体，插入型容纳片段小于7kb，适合于构建cDNA文库，置换型容纳9-25kb，适合于构建亚克隆文库或直接构建基因组文库。 3、粘粒文库：一般用于直接构建基因组文库，最长插入片段比λ文库略长，达45kb左右。 4、人工染色体文库：有细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1人工染色体(PAC)等文库，最大插入片段分别为300kb、1000kb和300kb，是大片段文库，主要用于基因组测序和物理图谱构建。 5、亚基因组文库：相对于基因组文库提出的，文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的某一区段。亚基因组文库主要应用在基因组较小的物种基因克隆或大基因组物种的后期研究。 ;文库的代表性和随机性;为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目，Clark和Carbon于1975年提出如下的计算公式：N=ln（1-p）/ln（1-f） N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数?p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率 ?f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组DNA大小的比值;哺乳动物：3*109bp 若p=99%，平均克隆片段长度20kb f=20kb/3*107kb N=690773.2 E.Coli：4639221bp p=99%，f=20kb/4600kb N=1056.9 p=99%，f=10kb/4600kb N=2116;随机性既表示构建文库时要从基因组DNA获得随机断裂的片段，也表示构建好的文库中所有基因要有相等的筛选概率。;载体的选择;基因组DNA文库的构建流程 ;;1、基因组DNA文库的载体制备 载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。 2、高质量大分子量基因组DNA的提取和部分酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对 DNA 质量要求不同，一般所提取的 DNA 分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的 3～5 倍。实践表明，提取的基因组 DNA 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。;培养的单细胞 组织 血液 ;3、文库的连接转化或包装侵染??? 一般在构建大片段基因组 DNA 文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。 在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白，同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。 4、文库的质量检测??? 文库的质量是由文库所含克隆的数目、平均插入片段的长度、插入效率、基因组覆盖度和覆盖倍数等因素所决定的。 在文库的质量检测中，除了克隆子数目是可以确定的，其它值都是估算的。;基因组覆盖倍数的计算方法一般包括两种： 一是公式计算法，基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度×克隆数/基因组 DNA 的长度（一般是约数）； 另一种算法是结合基因组覆盖度的检测来进行的。 基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。由于所使用的每个探针筛选的克隆数目即表明文库中对该基因位点的覆盖倍数，因此，基因组覆盖倍数又等于所有探针筛选到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比值。;基因组DNA文库克隆子的保存;2、文库在液体培养基中扩增保存 方法：从琼脂平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70 oC储存（加终浓度为25%的甘油）。 缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。