Ⅰ型胶原基因的克隆及其在正常及年龄相关性白内障晶状体上皮细胞的表达论文.docVIP

　　Ⅰ型胶原基因的克隆及其在正常及年龄相关性白内障晶状体上皮细胞的表达论文 刘燕 周健 刘新平 药立波 苏景宽 惠延年 【关键词】 胶原 Cloning of collagen typeⅠgene and its expression in lens epithelium in normal and agerelated cataractous people 【Abstract】 AIM : To clone the gene of collagen type Ⅰ, to study its expression in lens epithelium of normal and agerelated cataractous people, and to pare the difference of their expression. METHODS: The collagen type Ⅰ gene proved subtractive hybridization, and the fragment of collagen type Ⅰ cDNA al and cataractous lens. RESULTS: Collagen type I gene expressed both in the normal and the agerelated cataractous lens epithelium. The positive cell rate al and the agerelated cataractous lens epithelium. There is no significant differences in the expression of collagen type Ⅰ gene in the tay play an important role in the etiology of cataract and the formation of posterior capsule opacification after cataract surgery. 【Keyessenger;cataract; lens;epithelial cells 【摘要】 目的： 克隆Ⅰ型胶原基因并研究其在正常晶状体和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞的表达，并比较二者表达的差异.方法： 用改良的消减杂交法克隆Ⅰ型胶原基因，地高辛标记Ⅰ型胶原cDNA片段制作探针，用原位杂交法研究其在晶状体前囊膜切片上的表达，并作统计学处理. 结果： 克隆到了Ⅰ型胶原基因的cDNA片段，长约600 bp，Ⅰ型胶原在正常晶状体和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中均有表达；阳性细胞百分率分别为(730±149)%和(750±163)%.freelRNA提取试剂盒（Poly A Tract System 1000）（Promega公司）；Superscript Ⅱ反转录酶（Gibico公司）； Sephacryl S400柱（Promega公司）；链亲和素磁珠（Promega公司）；BiotindUTP（Clontech公司）；KlenTaq LA酶（Clontech公司）；LaTaq酶（TAKARA公司）；地高辛DNA标记和检测试剂盒（德国Roche公司），质粒提取试剂盒（上海华舜生物工程公司），胶回收试剂盒（Gibco公司），琼脂糖和高纯度去离子甲酰胺以及硫酸葡聚糖来自美国Sigma公司，鲑鱼精DNA（Clontech公司），Triton X100 (Sigma公司), 蛋白酶k( Sigma公司),正常山羊血清（武汉博士德公司），50 Denhardts液(由本实验室自配）.引物为随机引物六聚体,在地高辛标记盒内已带.紫外分光光度仪购自美国BECKman公司. 12方法 121Ⅰ型胶原基因的克隆利用改良的消减杂交法，以皮质性年龄相关性白内障组为实验组，以正常晶体囊膜组为扣除组，经过mRNA的提取、反转录、扣除探针的制备、杂交以及目的片段的选择性PCR扩增、cDNA的克隆纯化以及酶切鉴定，从而获得年龄相关性白内障的差异表达cDNA文库.经过对克隆产物的序列分析，获得很多目的片段，其中Ⅰ型胶原的cDNA片段即在其中，片段长600 bp, 构建于质粒载体并保存于DH5α菌种中［1］. 122切片制作将囊膜组织自－７０℃冰箱中取出，置低温恒冷箱切片机中切片，厚度为10 μm，切片贴于经明胶处理的载玻片上，经40 g/L多聚甲醛固定，室温20 min，再用ＰＢＳ冲洗，梯度乙醇脱水各2 min，切片干燥后，置密封盒并加干燥剂存于－70℃，可保存数周. 123探针的标记用Roche公司的地高辛试剂盒标记，将Ⅰ型胶原基因的ｃＤＮＡ菌种从－７０℃