丙型肝炎病毒NS4B对肝细胞cmyc和ras蛋白表达的影响论文.docVIP

　　丙型肝炎病毒NS4B对肝细胞cmyc和ras蛋白表达的影响论文 陈霞 李昌平，徐建玉，陈枫 【摘要】 目的 研究丙型肝炎病毒非结构蛋白4B(NS 4B)对肝细胞内癌基因cmyc和ras蛋白表达的影响，从而探讨其在肝癌发生机制中的可能作用。方法 通过脂质体介导法，将空白载体PX2及丙型肝炎病毒NS4B重组质粒PCXN2NS4B引入Chang肝细胞内，并G418筛选作稳定传代，RTPCR法鉴定质粒成功转染入肝细胞内，免疫细胞化学方法观察细胞内cmyc和ras表达情况。结果 获得具有G418抗性的Chang肝细胞；空白对照组及空白载体组无cmyc表达.freelyc表达率为(21.3±1.2)%，与空白对照组及空白载体组比较差异有显著性；空白对照组及空白载体组ras弱阳性表达，转染NS4B组ras呈阳性表达，与空白对照组及空白载体组比较差异有显著性。结论 丙型肝炎病毒NS4B可促进癌基因cmyc和ras表达，并可能在丙型肝炎病毒的致癌机制中起重要作用。 【关键词】 丙型肝炎病毒 非结构蛋白4B cmyc;ras;G418 The Effect of HCV NS4B on Expressions of cmyc Protein and ras Protein in Hepatic Cells. Key yc;ras;G418 丙型肝炎为全球流行性传染性疾病，据估计全球丙型肝炎病毒（HCV）感染者超过1亿人。原发性肝癌（HCC）是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势，HCV与HCC关系密切，但HCV致肝癌的机制至今仍未明了，HCV是一种RNA病毒，无逆转录酶活性，也不与宿主基因整合，并且其本身没有一个可知的癌基因。其致癌作用可能与细胞凋亡受抑，癌基因及抑癌基因的突变及表达量的异常，细胞信号传导异常等有关。cmyc和ras为重要的原癌基因，大量的研究发现，cmyc和ras在HCV相关肝癌中起重要作用。迄今为止，HCV NS4B的功能尚不明确，HCV NS4B是否可影响相关癌基因与抑癌基因的表达,国内外未有相关文献报道。本研究利用脂质体介导技术将外源性基因NS4B导入正常肝细胞内，并G418筛选稳定传代，将cmyc和ras作为检测指标，探讨HCV NS4B可能的致癌作用。 1材料和方法 1.1 材料 1.1.1细胞与质粒 Chang肝细胞株，由四川大学华西医学中心王修杰教授惠赠;空白载体PCXN2及PCXN2NS4B质粒，李昌平教授构建并保存。 1.1.2试剂 培养基RPMI1640（Gibco公司），小牛血清（成都哈里生物公司），TritonX100,G418（上海Sangon公司），脂质体转染试剂Dosper(德国Roche公司)，Trizol RNA提取试剂（Gibco美国）,RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI)，ras多克隆抗体（Neomarker公司），cmyc抗体（Boster公司），SP超敏试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）。 1.2方法 1.2.1细胞培养 用RPMI1640(含10%小牛血清)将Chang肝细胞培养于37℃,5%CO2孵箱中,每2～3d换液一次。 1.2.2基因转染及筛选 取对数生长期细胞,转染前一天消化以3×105/ml接种于6孔板中,置于37℃、5%CO2孵箱中培养,待细胞生长达70%融合,将肝细胞分为3组,空白对照组（未转染的Chang肝细胞）、空白载体组（PCXN2转染组），PCXN2NS4B转染组，每组设两个复孔，转染前以无血清培养基洗细胞3次，以1.5μg/6μg配制质粒/脂质体混合物，轻柔混合后室温下静置15min，将混合物逐滴加入相应各孔，空白对照组加入等体积无血清培养基，6h后更换转染培养基，加入完全培养基继续培养，24h后加入G418（1 000mg/L）筛选，待对照组细胞全部死亡后，G418 减量为200 mg/L维持筛选并传代培养。 1.2.3RTPCR转染细胞鉴定 细胞生长足量时，Trizol试剂分别提取PCXN2组及PCXN2NS4B组总RNA，逆转录合成cDNA，按试剂盒说明书建立反应体系，取RTPCR产物10μl行琼脂糖电泳（具体操作按说明书进行）。 1.2.4免疫细胞化学方法检测cmyc及ras蛋白的表达 将空白对照组、PCXN2组及PCXN2NS4B组细胞分别消化接种于经多聚赖氨酸处理的盖玻片上,置于37℃、5%CO2孵箱中培养24h,PBS洗细胞3次,.freelin,0.3% TritonX100通透细胞30min,过氧化物酶阻断剂孵育10min,非免疫性动物血清中孵育10min,加一抗4℃冰箱过夜后,