丙氧鸟苷对转TK基因的人外周血单个核细胞的毒性作用论文.docVIP

　　丙氧鸟苷对转TK基因的人外周血单个核细胞的毒性作用论文 .freelonocytes;gancicloir Abstract:AIM To explore the ia（GVL）effect maximally in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.METHODS Viral thymidine ki-nase（TK）gene，green fluorescent protein（GFP）gene and the bacterial neomycin-resistance（NeoR）gene an peripheral blood mononuclear cells（PBMC）ajor transduced cells e of the infected target cells，integrated NeoR gene inated TK-transduced T lymphocyte in case GVHD develops is pos-sible. 0 引言 逆转录病毒载体介导的基因转移是近年发展起来的基因转移技术［1］ .随着干细胞移植治疗恶性血液病的广泛深入，寻求减少移植物抗宿主病（GVHD），同时最大限度发挥GVL效应的方法是干细胞移植的重要课题之一［2］ .我们以逆转录病毒载体介导将HSV-TK基因导入人外周血单个核细胞（PBMC），观察其表达及丙氧鸟苷（GCV）对转化细胞的毒性作用. 1 材料和方法 1.1 材料 DMEM培养基（粉剂），由Gibco公司出品;rhIL-2购自北京中化合通药业有限公司，批号960310;CD3mAb由军事医学科学院生产;PHA-P，噻唑蓝由Sigma公司出品，购自北京天象人生物工程公司;藻红素（PE）标记鼠抗人CD3，CD4，CD8，CD19，CD33mAb购自深圳晶美生物工程有限公司;GCV购自罗氏药业有限公司.PA317/GCGFPPT-SN为含GFP基因、HSV-TK基因、NeoR基因的逆转录病毒包装细胞株、NIH3T3细胞株，均由上海东方肝胆外科医院钱其军博士惠赠. 1.2 方法 PA317/GCGFPPTSN包装细胞在含500mg L-1 G418的DMEM中培养，培养条件为37℃，50mL L-1 CO2 饱和湿化空气中培养.基本成层后，弃上清，换用无G418的新鲜培养液继续培养18～24h后，收集上清，以NIH3T3细胞株检测病毒滴度.病毒效价=集落数×上清稀释倍数（×103 CFU L-1 ）.取健康志愿献血者外周血5～8mL，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用生理盐液洗2遍，悬浮于2mg L-1 PHA:10μg L-1 CD3 mAb:5×105 U L-1 rhIL-2和200mL L-1 胎牛血清的DMEM培养中，置37℃，500mL L-1 CO2 的饱和湿度培养箱中培养3～5d.取上述培养3～5d的PBMNC悬浮于8mg L-1 polybrene，100mg L-1 rhIL-2的病毒上清，孵育8～12h后，去除病毒上清及polybrene，加入含200mL L-1 胎牛血清的新鲜培养液，1～2d后，重复上述步骤，继续与病毒上清孵育、去除病毒上清、加新培养液，如此反复转染2～3次.转染病毒滴度与细胞比为10∶1. 1.2.1 倒置显微镜观察 取转染后细胞制成细胞悬液，相差镜头下观察，计数视野中细胞数，转换荧光光源，观察GFP所发出的绿色荧光，计数荧光细胞数. 1.2.2 FACS分析 取转染细胞分加于6支试管，每管约2×105 细胞，一管为阴性本底，其余5管分别用PE标记鼠抗人CD3，CD4，CD8，CD19，CD33mAb进行细胞表面抗原标记.参照检测异硫氰酸荧光素（FITC）的常规方法（其激发波长475nm，发射波长490nm），调整流式细胞仪工作条件至GFP，工作电压525V，各管分别获取10000个细胞. 1.2.3 细胞基因组DNA提取与外源基因整合鉴定 PCR检测NeoR基因，常规方法进行转染后外周血单个核细胞基因组DNA提取，并以此DNA为模板，用NeoR基因引物进行PCR扩增（产物790bp）.P1:5’CAA GAT GGA TTG CAC GCA GG3’，P2:5’CCC GCT CAG AAG AAC TCG TC3’.反应条件:95℃水浴变性5min，加Taq酶2.5U，然后进行28个循环反应（55℃1min，72℃1min30s，94℃1min），接55℃1min，最后72℃延伸10min，PCR产物经10g L-1 琼脂糖凝胶电泳鉴定. 1.2.4 GCV抑制率