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1.样品制备 二聚体或多聚体：还原变性电泳 蛋白不同剪切体或isoforms :实验论证 蛋白降解：①使用新鲜样品②加蛋白酶抑制剂 上样量过大：减少上样量 2.封闭 封闭不充分：优化封闭时间和浓度 3.抗体孵育和检测 一抗/二抗浓度过高：降低抗体浓度 (主要是一抗) 抗体没有经过纯化:纯化或更换抗体 二抗非特异性结合：使用二抗对照 4.其他 洗膜保证充分 杂带问题 适当稀释一抗提高特异性 适当稀释二抗降低背景 二聚体或亚型 杂 带 目的条带 操作问题 一抗浓度不够:增加一抗浓度 抗体孵育不均匀:摇床 干膜: 保持湿润 细菌污染:①加防腐剂或更换抗体②配制新鲜缓冲液 补丁染色问题 补丁染色 微笑条带：主要由于凝胶中部聚合不完全，多见于较厚凝胶，也可由于上样量过大 室温静置充分凝固；调节上样量 皱眉条带：凝胶和玻璃挡板底部有气泡或凝胶两边聚合不完全或上样量过大①在两板间加入适量缓冲液②完全凝胶③重新配胶④调整上样量 表情条带 单孔皱眉 两边皱眉 微笑条带 单孔微笑 拖尾现象：主要是A.样品融解效果不佳; B.电泳缓冲液时间过长; C.分离胶浓度过大引起①加样前离心 ②加适量样品促溶剂③重配电泳缓冲液④降低凝胶浓度。 弥散现象：样品不溶性颗粒或凝固不充分或制胶问题 ①加样前离心； ②加适量样品促溶剂③