中药止哮平喘方抗哮喘豚鼠模型气道炎症的实验研究论文.docVIP

　　中药止哮平喘方抗哮喘豚鼠模型气道炎症的实验研究论文 胡作为，周电光，周燕萍，王鹏 【关键词】止哮平喘方 摘要：【目的】探讨中药止哮平喘方(主要由法半夏、瓜蒌皮、薤白、白芍、柴胡、黄芩、麻黄、枳壳、射干、甘草等中药组成)对哮喘豚鼠模型气道炎症的影响。【方法】复制卵蛋白致敏哮喘模型，观察支气管及肺的病理学改变；测量全血及肺泡灌洗液(BALF)中血细胞计数；免疫组织化学法测定外周血单核细胞(PBMC)中CD＋４、CD＋８T细胞的含量。【结果】病理研究显示哮喘模型组豚鼠气道周围大量炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞(EOS)和淋巴细胞为主。哮喘模型组全血及BALF中炎性细胞数显著高于正常组(Ｐ＜001)；中药大剂量组和西药对照组炎性细胞数均显著降低(Ｐ＜005或Ｐ＜001)。哮喘模型组CD＋４T细胞高于正常组(Ｐ＜005)；中药大剂量组和西药对照组CD＋４T细胞均有下降(与哮喘模型组比较，Ｐ＜005)。【结论】中药止哮平喘方能降低气道及外周血炎性细胞的数量，具有抗气道炎症的作用；降低CD＋４细胞数量.freela公司出品(进口分装)；016mol/L戊巴比妥钠；肝素用生理盐水配制成1250U/mL的溶液；小鼠抗大鼠SABC试剂盒(即用型)、鼠抗CD＋4及CD＋8多克隆抗体、DAB显色试剂盒均为武汉博士德生物工程公司产品；402超声雾化器，上海四菱医疗机械厂生产。 12实验动物及分组 清洁级健康豚鼠，体重(200±20)g，由同济医科大学医学动物中心提供。检疫1周后，豚鼠随机分为①正常对照组、②哮喘模型组、③西药对照组、④中药小剂量组、⑤中药大剂量组，共5组，每组10只(雌雄分笼饲养)。 13造模方法 以卵蛋白致敏和攻击加以复制。实验第1天，配制100g/L卵蛋白生理盐水，豚鼠腹腔注射1mL以致敏；第15天将致敏豚鼠置于14L透明玻璃钟罩内，给予10g/L卵蛋白生理盐水超声雾化吸入(雾化量由小到大)15～20s，后自然吸入15～20s，出现呼吸频率加快、点头呼吸、咳嗽、抽搐等症状时为引喘成功。以后每隔1天以10g/L卵蛋白生理盐水诱喘。按最大雾量，自然吸入15～30s，使哮喘反复发作(每次诱喘之前，每只豚鼠均腹腔注射苯海拉明5mg/kg)。共4次。正常对照组以等量生理盐水进行腹腔注射和雾化，方法同上。 14药物制备及给药方法 止哮平喘方(由法半夏10g、瓜蒌皮10g、薤白10g、白芍30g、柴胡10g、黄芩10g、麻黄10g、枳壳10g、甘草10g和射干10g组成)由湖北中医学院中药室制备(水煮醇沉法)，含生药2g/mL；地塞米松片，075mg/片，在第1次诱喘24h后，即从第16天开始按1mg kg－１胃饲给药；中药小剂量组止哮平喘方6g kg－１；中药大剂量组止哮平喘方24g kg－１；哮喘模型组及正常对照组均饲以等容量生理盐水。共治疗8d。 15标本采集及检测 151标本采集 称体重，016mol/L戊巴比妥钠1mL/kg腹腔内注射，麻醉。常规消毒，心脏采血，肝素抗凝，血细胞计数测定细胞总数，涂片、染色，作细胞学分析。摘取豚鼠肺脏，用无尖针头注射器置于气管分叉处，缓慢注入生理盐水(37℃)2mL，保留30s后抽出，重复4次。每例收集肺泡灌洗液6～7mL(回收率＞85%)，-4℃储存，1h内作细胞分离。BALF于1500r/min离心10min，沉淀细胞用1mLHanks液重悬。取01mL测定细胞总数；取02mL涂片，C)的制备和激活 称体重，016mol/L戊巴比妥钠1mL/kg麻醉豚鼠。常规消毒，心脏采血，抗凝。用淋巴细胞分层液分离淋巴细胞，用完全RPMI1640定容细胞并记数。台盼蓝染液检查PBMC活性，活性超过95%。另部分T淋巴细胞置于预先包被了抗CD3单抗的培养板中，37℃、体积分数为5%CO２常规培养24h。 153免疫组化 按常规步骤操作［１］，设阴性替代片和空白对照显色，阳性细胞表达为棕黄色。免疫组化片每组随机选择5张，在200倍光镜下观察。每张随机选取5个视野，计数200个细胞中阳性细胞所占比例，取其平均值。 154形态学观察 每组选取右肺中叶以体积分数为10%的市售甲醛固定，常规石蜡包埋行HE染色，观察各组豚鼠支气管、肺组织的形态学改变。 16一般情况观察 观察实验过程中各组豚鼠的精神、活动、饮食、排便、皮毛及死亡情况。 17统计分析 所有数据采用(x±s)表示，统计分析采用t检验。 2结果 21一般情况 豚鼠致敏后普遍精神较差，活动减少，1～2d后逐渐恢复正常。第3周哮喘模型组3只豚鼠出现皮毛蓬松；西药对照组有1只脶鼠，中药小剂量组有2只豚鼠出现明显皮毛蓬松现象。最后1次诱喘时，哮喘模型组1只豚鼠哮喘发作严重，经给氧抢救后