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实验二 从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定 土壤是微生物生活的大本营，微生物的种类和数量极其丰富，从土壤中可分离、纯化得到许多有价值的菌株。 从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程即微生物的分离纯化，常用平板分离法，为获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、T、氧气等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某些抑制剂抑制其他菌生长，从而淘汰其他不需要的微生物，如高氏一号，加酚液为抗菌药物，抑制细菌，马丁氏加孟加拉红、氯霉素（类抗生素，还有红霉素、磺胺，抑制细菌和放线菌，不抑真菌），再用平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌株。 第一部分 培养基的配制 实验目的和内容 目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。 内容：1、牛肉膏蛋白胨培养基的配制；2、高氏一号培养基的配制； 3、马丁氏培养基的配制。 实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、氯霉素、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4.3H2O、MgSO4.7H2O、FeSO4.7H2O。 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布。 操作步骤 牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15~20g、水1000ml、pH7.4~7.6。 1、称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速，并及时把试剂瓶盖紧. 2、加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。 3、调pH 用pH试纸或酸度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/LHCl进行调节。pH调节通常放在加琼脂之前。注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4、过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养结果的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。 5、分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。（分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。）分装量：固体培养基约为试管高度的1/5；分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。 6、加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 7、包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养基的试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 8、灭菌 将上述培养基于121.3oC 湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。 9、摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2；待其凝固。 10、无菌检查 将灭菌的培养基放入37oC温箱中培养24~48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱或清洁的橱内，备用。 高氏1号培养基的配制 高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下： 可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g,K2HPO4.3H2O 0.5g, FeSO4.7H2O 0.01g, 琼脂15~20g, 水1000ml, pH7.4~7.6。 1、称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。对微量成分FeSO4.7H2O可先配成高浓度的储备液后再加入,方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4.7H2O,配成浓度为0.01g/mL的储备液,再在1000mL培养基中加入以上储备液1mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2、pH调节、分装、包扎、灭