科研项目标书写作讲座-副本_培训课件.ppt

* * * * * * * * * （1）人晶状体上皮细胞的获得：老年性白内障晶状体上皮细胞取自白内障患者手术中取出的前囊膜（晶状体上皮细胞紧贴于前囊膜），直径约5mm。正常晶状体上皮细胞取自角膜移植供体眼的晶状体，在显微镜下撕下前囊膜，直径约8mm。按文献提供的方法去除晶状体纤维细胞，仔细清洗以去除血细胞污染。 （2）建立差异cDNA文库：从50例白内障手术患者的前囊膜上取下的晶状体上皮细胞作为实验组，从25例正常晶状体前囊膜上取下的晶状体上皮细胞作为对照组，利用改良的消减杂交技术[19，20]，获得差异表达的cDNA，并建立文库。主要的实验流程如下： 正常晶状体上皮细胞 白内障晶状体上皮细胞 Promega PolyATtract? System 1000 mRNA分离 mRNA分离 oligo-dT18反转录 ntech Cap-finder方法反转录 cDNA Biotin-21-dUTP pending-cDNA 随机引物PCR 杂交 Sephacryl S-400柱 除盐及小片段 链亲和素-生物素磁性分离 除去杂交体及过量正常晶状体上皮细胞cDNA “长距离”PCR 目的cDNA的特异扩增 克隆、鉴定、转化 建立差异基因文库 （3）制备基因芯片筛选白内障相关基因： ① 基因芯片的制备： ……… ②白内障相关基因的筛选：…… （4）白内障相关基因的结构分析： ① 序列测定：... ... ② 序列的计算机分析： ... ... ③ 获得全长基因： ... ... （5）基因转染： ① 培养人晶状体上皮细胞的转染：…… ② 在体晶状体的转染：…… 6、可行性分析 对实验方案设计的分析 理论分析 研究手段方法分析 预实验结果分析 对相关条件的分析 所用特殊实验材料（试剂）的分析 对所具备的实验条件进行分析 对项目组成员搭配及其运用技术方法的能力分析 (1)关于建立差异cDNA文库： 老年性白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞是处在不同状态下的细胞，细胞基因表达的改变 是细胞蛋白功能等改变的基础。寻找这些有差异的基 因是探索细胞功能、状态变化原因的突破口。利用的 消减杂交技术是筛选差异表达基因的有效方法。改良 的消减杂交技术是我们研究组成员建立的方法，应用 此方法已经从脂多糖刺激前后的人牙髓细胞的差异表 达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异表达的基因，其 中 5个为新基因，这一研究成果进一步证实了该方法 的可操作性，而且我们在运用此方法过程中也积累了 较丰富的经验，因此，本研究利用这一方法从两种状 态的晶状体上皮细胞中筛选差异表达的基因并建立 cDNA文库是可行的。 7、创新性 存在问题： 对创新点提炼不够 把运用新技术、新方法理解为创新 与研究目标、研究内容相混淆 对创新的理解： 原始创新：填补空白或修改传统的理论 发明创造新技术、新方法 跟踪创新：补充、完善现有理论 修改、完善现有技术方法（1＋1＞2） 提炼方法：用逆向思维方法提炼创新点 （