人疱疹病毒7型U14编码区原核表达载体的构建论文.docVIP

　　人疱疹病毒7型U14编码区原核表达载体的构建论文 孙坚萍 王笑峰 王云 罗兵 【关键词】 疹病 ［摘要］ 目的 构建人疱疹病毒7型(HHV7)开放读码框（ORF) U14的原核表达载体，并且进行原核表达。方法 PCR技术扩增HHV7 ORF U14基因的主要抗原决定簇编码区（328～533氨基酸），目的基因与原核表达载体pThioHis A分别双酶切后连接，1×TSS法转化宿主菌E.coli BL21，异丙基βD硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达。结果 基因序列分析表明目的基因序列与HHV7标准毒株相应序列基本一致，SDSPAGE电泳可观察到相对分子质量为3.57万融合蛋白的表达，ethods The major antigen epitopes coding sequence （328―533 aa） of HHV7 ORF U14 gene plified by PCR and inserted into the prokaryotic expression vector pThioHis A by gene engineering technique; rebinant plasmid ed into E.coli BL21 and expressed by IPTG inducing. ResultsThe target gene an herpesvirus 7; tegument protein pp85; prokaryotic expression 人疱疹病毒7型(HHV7)属β疱疹病毒，通常经唾液传播，与慢性疲劳综合征、慢性EB病毒样感染、幼儿急疹及器官移植病人的并发症相关，在人类免疫缺陷病毒感染者中可引起致命性并发感染。大多数幼儿在3岁前就已感染此病毒并潜伏在外周血单个核细胞中呈终身潜在感染，因此约80%成年人的外周血单个核细胞中有低拷贝数的此型病毒的序列存在。β疱疹病毒除HHV7以外，已经发现并证实的还有巨细胞病毒及人疱疹病毒6A和6B，其基因组具有共线性。其中HHV6和HHV7无论是致病性还是基因组序列，都有较大的相似性，HHV7基因序列与人巨细胞病毒也有一定程度的同源性，因此，HHV7感染的特异性诊断存在许多障碍。HHV7的全基因组序列已有报道［1］，对其所编码的蛋白也已进行了分析。近来认为被膜蛋白pp85是HHV7的主要免疫性抗原，具有高度的特异性［2～4］。本研究应用原核表达载体表达pp85蛋白的部分主要抗原决定簇基因，所获融合蛋白为进一步完善HHV7抗体检测奠定基础。 1 材料和方法 1.1 菌种和质粒 宿主菌E.coli BL21和质粒pThioHis A由中国疾病控制中心性病艾滋病中心病毒免疫室邵一鸣教授惠赠。 1.2 PCR引物设计 应用DNAstar软件设计扩增HHV7 ORF U14基因编码C末端328～533氨基酸区段的特异性引物［5］，并在上下游引物的5′端分别引入SalⅠ和KpnⅠ酶切位点和保护性碱基，两条引物的序列分别为：上游引物5′CGGTACCTTGTATTTTGCCTTCTTTTG3′，下游引物5′GCGTCGACGGGGATGTTCTATTCTC3′，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增产物为633 bp。 1.3 PCR目的基因的制备 收集健康携带者唾液3 mL，蛋白酶K裂解，酚氯仿异戊醇法常规提取DNA。以提取的唾液DNA为模板，反应体系25 μL，包括10×buffer 2.5 μL，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.3 mmol/L，Taq 1 U，模板2 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物于含溴化乙锭（0.5 g/L）的12 g/L琼脂糖凝胶中电泳检测。扩增产物连入pMD18T载体，进行序列测定。 1.4 pp85原核表达载体的构建 用SalⅠ和KpnⅠ分别对PCR产物及载体pThioHis A同时进行双酶切，用QIAGEN试剂盒（德国）回收目的基因片段和载体片段，T4 DNA连接酶进行连接。连接产物转化TSS法敏化的宿主菌E.coli BL21，在ALB(氨苄青霉素浓度100 mg/L)琼脂平板上筛选阳性转化菌，通过质粒小量快提进行筛选鉴定，同时对筛选的质粒用SalⅠ以及KpnⅠ双酶切鉴定重组质粒，阳性克隆由上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。 1.5 重组质粒的诱导表达 将鉴定出的重组菌用ALB培养基进行培养，200～225 r/min离心，37 ℃培养至吸光度（600 nm）约为0.2时，加入异丙基βD硫代半