人红细胞20S蛋白酶体的蛋白质组学表征及不同来源20S蛋白酶体异质性的研究论文.docVIP

　　人红细胞20S蛋白酶体的蛋白质组学表征及不同来源20S蛋白酶体异质性的研究论文 陈国强 刘辉 张海婧 邓艳春 李智立 【摘要】 通过整合差速离心和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(nativePAGE)技术，建立了能有效分离20S蛋白酶体（20S core particle，CP）的方法。与传统纯化方法比较，此方法具有经济、快速的特点，并且能够对不同组织细胞来源的CP进行分离。利用本方法对人红细胞来源的CP亚基进行了2DE分离和MALDITOF/TOF MS鉴定。结果显示，可鉴定出33个具有不同相对分子量和等电点的蛋白点，此数量远远多于CP亚基的14种。此外，利用非变性/变性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（native/SDSPAGE）技术）；二维凝胶电泳（2DE）系统（美国GE Healthcare公司），包括Ettan IPGphor III等电聚焦仪及DALTsix垂直电泳设备；超速离心机Optima XL80 （美国Beckman Coulter公司），配有SI 1640培养基中培养的人胰腺癌细胞系SEM培养基中培养的人胰腺癌细胞系PANC1。 2.2 实验方法 2.2.1 差速离心 在2 g酵母、2 g小鼠肝脏（已碾碎）、2 mL红细胞、2 g SgCl2, 0.5 mol/L NaCl, 1 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）, 1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）, 10 mmol/L NaF和10 mmol/L Na4P2O7），4 ℃放置1 h（在酵母裂解液中加入酸洗玻璃珠进行机械振荡破碎），然后进行差速离心：115000×g，150 min，吸取上清；再对此上清液进行离心，243000×g，240 min，小心倒去上清液，用300 μL溶液（20 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）, 5 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L DTT）将沉淀重悬后，离心去除不溶物，此上清液即为部分纯化的含CP的蛋白质混合物样本（crude CP，cCP）。 2.2.2 NativePAGE、native/SDSPAGE和2DE nativePAGE按照文献8的方法进行。native/SDSPAGE的操作步骤：将经过nativePAGE后含CP的蛋白条带切下，用乙腈完全脱水后，加入50 μL溶液（250 mmol/L TrisCl（pH 6.8），20%甘油，2% SDS，40 mmol/L DTT和痕量溴酚蓝）。再加入300 μL水，静止60 min，吸取上清液，此步骤重复2次。将合并后的上清液真空抽干至一定体积（约50 μL）后，进行12.5% SDSPAGE分离。2DE的操作步骤：CP条带经脱色（50%乙腈和25 mmol/L NH4HCO3）和乙腈脱水后，加入550 μL溶液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2% 33(胆酰胺丙基)二甲氨基丙磺酸内盐（CHAPS），1.2% DestreakTM试剂和0.5% IPG Buffer（pH 3～10, 非线性）），将条带用镊子充分碾碎后再进行第一维等电聚焦电泳分离，之后进行第二维12.5% SDSPAGE分离。 2.2.3 蛋白酶切 切下经nativePAGE分离后的CP银染条带，用15 mmol/L K4Fe()6和50 mmol/L Na2S2O3溶液将其脱色后，再进行胰蛋白酶酶切9，并将此酶切上清液进行LCMS/MS鉴定。切下2DE胶上蛋白点，按照文献9的方法进行脱色和酶切。 2.2.4 液相色谱串联质谱分析（LCMS/MS） MicroTech Scientific MN15C18S/MS扫描。 2.2.5 基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱（MALDITOF/TOF MS） 取胰蛋白酶酶切后上清液1 μL，点样于MTP AnchorChip靶上，室温自然干燥后，加上1 μL 0.67 g/L CHCA（用含70%乙腈和0.1%三氟乙酸的溶液配制），待完全干燥后进行MALDITOF/TOF MS鉴定。 3 结果与讨论 3.1 CP的分离 为了证明整合差速离心和nativePAGE能有效分离CP，本研究直接对经差速离心后得到的红细胞cCP进行了nativePAGE分离，并用AgNO3染色。如图1A所示，cCP经5.5% nativePAGE电泳1 kV·h后，在泳道cCP中观察到一条带的电泳迁移距离与蛋白酶体标准品中的CP（泳道M）相近。为了证明泳道cCP中的蛋白条带为含CP条带，切下该条带，并进行胶内胰蛋白酶酶切和LCMS/MS鉴定。结果显示，亚基α2序列中的 GYSFSLTTFSPSGK, LVQIEY