P6蛋白在草莓镶脉病毒致病过程中的功能研究.pdf

中文摘要 植物病毒致病性的强弱往往与其基因组编码的症状决定因子密切相关，即症状决定因 子能够协助该病毒成功侵染寄主，使寄主呈现发病症状甚至死亡。本研究克隆了草莓镶脉 病毒（SVBV ）中国分离物P6 基因，以病毒载体携带P6 基因或P6 突变体基因接种本氏烟， 并以双元表达载体携带P6 基因转化本氏烟和普通烟，观察接种植株以及转基因植株症状表 型，明确P6 在病毒侵染和症状形成中的作 ，以确定SVBV P6 的症状决定子功能。本研 究最终将在分子水平上明确SVBV 的致病机制，对进一步研究寄主植物和病毒之间防御和 反防御的分子机制以及控制病毒病危害均具有重大意义。 1. SVBV P6 基因的克隆及序列分析 从感染SVBV 的草莓叶片中提取总DNA ，设计特异性引物扩增SVBV P6 全长基因， 克隆并测序。得到的SVBV 中国分离物 P6 基因序列 （SVBV-CH P6 ）全长1557 bp ，编码 518 个氨基酸 （AA ）。将其与 SVBV 美国分离物（SVBV-NC001725 ）以及花椰菜花叶病 毒属其它成员的P6 全长基因序列相比较，结果表明，SVBV 中国分离物P6 基因与SVBV 美国分离物P6 基因核苷酸序列相似性最高，达84.5%；而与花椰菜花叶病毒属其它成员的 P6 基因序列相似性均较低，仅为23.7%~27.9% 。构建SVBV 及其同属其他成员P6 基因的 系统关系树，结果显示，SVBV 中国分离物与SVBV 美国分离物单独形成一个分支，说明 来源于草莓的2 个SVBV 亲缘关系最近，而与其同属其它成员的亲缘关系均较远。生物信 息学分 表明，SVBV P6 基因表达的P6 蛋白序列含有多种蛋白激酶磷酸化位点，其二级 结构N 端是一个 -螺旋富集区。 2. SVBV P6 基因及其系列缺失突变体植物表达载体的构建 将SVBV 2 个分离物P6 基因及其缺失突变体基因分别克隆到病毒载体pGR 106 上，获 得阳性克隆pGR-CH P6 ，pGR-US P6 ，pGR-CH △P6 和pGR-US △P6 ；将2 个P6 基因克 隆到双元表达载体pCAM 2300 上，获得阳性克隆pCAM-CH P6 ，pCAM-US P6 。 3. 表达载体以根癌土壤杆菌介导进行瞬间表达 利 电击转化方法，将表达载体pGR-CH P6 ，pGR-CH △P6 ，pGR-US P6 ，pGR-US △P6 表达载体和pGR 106 空载体导入根癌土壤杆菌，分别接种本氏烟叶片。15 d 后，观察本氏 烟系统叶发病情况。pGR-CH P6 ，pGR-US P6 表达载体接种的本氏烟系统叶呈现严重的花 叶症状，顶部叶片皱缩，下卷；pGR-US △P6 ，pGR-CH △P6 表达载体接种本氏烟后，其 系统叶呈现轻花叶症状，顶部叶片基本可以展开，无明显下卷症状；接种pGR 106 空载体 的系统叶只呈现PVX 病毒典型的轻花叶症状，顶部叶片发育正常。 4. 瞬间表达烟草中P6 因的分子检测 提取接种本氏烟的总RNA ，RT-PCR 检测PVX 病毒片段和P6 基因。结果发现，接种 pGR-CH P6 ，pGR-CH △P6 ，pGR-US P6 ，pGR-US △P6 的本氏烟系统叶中检测到P6 基因 片段和PVX 病毒特异性片段。而接种空载体pGR 106 的本氏烟系统叶中则检测不到P6 基 I 因片段，只能检测到 PVX 病毒特异性片段。检测到 P6 基因的本氏烟进一步进行半定量 RT-PCR 检测，发现插入P6 基因的表达载体和突变体表达载体接种的本氏烟，P6 基因转录 RNA 水平无明显差异。 5. 瞬间表达烟草中P6 蛋白对PVX 复制量的影响 pGR-CH P6 、pGR-CH △P6 和pGR 106 分别接种本氏烟，双抗体夹心ELISA 法检测本 氏烟系统叶中PVX 的复制量。结果发现，接种pGR-CH P6 的本氏烟系统叶中，PVX 的复 制量最高，较接种空载体pGR 106 的本氏烟中PVX 的复制量提高了60.7% ；接种pGR-CH △P6 的本氏烟系统叶，PVX 的复制量与对照相比差异不明显。 6. 转 因烟草的分子鉴定及症状观察 将构建的表达载体pCAM-CH P6 转入根癌土壤杆菌，叶盘法转化本氏烟和普通烟。提 取转基因烟草