【2017年整理】脂肪与干细胞培养201135.doc

干细胞论坛 脂肪干细胞培养 吸脂术时用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织20 mL. 在1 h内将其移至离心管内，加入等量PBS缓冲液，充分振荡后低速离心800 r/min×10 min. 反复冲洗3次后加入等量15 g/L I型胶原酶. 37℃水浴中充分振荡30 min，再加入等量胎牛血清（FBS）中止. 低速离心10 min后弃去上清. 将下层细胞用PBS悬浮后加入16 mmol/L NH4Cl 37℃水浴中10 min以裂解红细胞. 低速离心10 min后再用PBS冲洗3次. 最后将细胞用含100 mL/L FBS+10 g/L青霉素的DMEM悬浮后移入培养瓶中，37℃，50 mL/L CO2培养箱中孵育，48 h后首次换液，弃去悬浮细胞. 随后每3 d换液，1 wk后传代. 将第3代细胞用于流式细胞仪检测. 浓集细胞到109/L后进行流式细胞仪检测. 细胞传至第3代时将其以2×107/L的细胞数分别转入各定向培养基中进行培养. 诱导培养2 wk后，对成脂诱导组进行油红Ｏ脂肪颗粒染色， 另外： 现在脂肪干细胞缺乏特异的表面标志鉴定，各类文献提到脂肪干细胞表达阳性的标志物 有：cd13，cd29，cd59，cd49e，cd73，cd90，HLA-ABC等。但表达阳性不代表具有特异性，所以要从标志物上鉴定脂肪干细胞还 是很困难的，应该说不具有很强的说服能力。 按文献所说的步骤来提取脂肪干细胞，形态类似干细胞，并且具有多向分化的能力，这就足以说明提取的细胞是干细胞。你要是想证明你养的就是干细胞，最好的办法我认为还是做个多向诱导分化。吸出来以后，常速离心，用pbs洗两遍后，accutase管内消化5-10min，加入基础培养基离心洗去消化液，分瓶传代。人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定 [摘　要] 　 目的: 进行人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定, 为组织工程的进一步研究提供实验依据。方法: 将剪碎的人脂肪组织加入型胶原酶消化, 离心。将细胞悬液置于6 孔培养板中, 37 、5 %CO2 培养箱中培养, 细胞达80 %融合时进行传代。选取第3 代细胞, 进行免疫组织化学染色, 检测细胞表面抗原标记物;选取第3 代细胞, 分为成骨诱导组和成脂诱导组, 每组又分为诱导组(加入相应诱导培养基) 及对照组(未经诱导的细胞) 。成骨诱导72 h 后进行碱性磷酸酶(A KP) 含量检测, 8 d 后进行茜素红染色, 检验细胞内是否出现钙沉积; 成脂诱导2 周后进行油红O 染色, 检测细胞内是否形成脂滴。结果: 培养细胞均有CD44 、CD49d 抗原阳性表达, 不表达CD45 、CD106 抗原; 成骨诱导72 h 后, 诱导组细胞内A KP 含量(01488 3 U ?g - 1 prot )较对照组(01063 2 U ?g - 1prot) 明显增高( P 0105) ; 8 d 后诱导组茜素红染色阳性, 对照组阴性; 成脂诱导2 周后油红O 脂肪颗粒染色为阳性, 对照组为阴性。结论: 利用原代细胞培养技术可成功地从人脂肪组织中分离出脂肪干细胞。[关键词] 　干细胞; 细胞分离; 细胞培养　???? 组织缺损是整形外科常见的疾病, 包括骨、软骨、脂肪等多种组织的缺损。自体组织移植是目前最常用的方法, 但其主要问题包括容易坏死和吸收、组织量有限、供区瘢痕等, 因此往往无法达到预期治疗效果。组织工程是人体组织修复的理想方法, 其中种子细胞的选择非常重要。目前, 可被选用作为组织工程种子细胞的主要为各种类型的干细胞, 而成体干细胞中的脂肪干细胞( adipose2derived stem cell s , ASCs) 具备来源丰富、可反复取材、痛苦小、易扩增、能安全植入同体或异体等优点, 且无道德争议, 具有比骨髓干细胞更多的优点。因此ASCs 是组织工程优秀的种子细胞。目前, 国内研究者对于ASCs 的研究开展较晚, 且尚无系统应用于临床的报道。本研究通过原代细胞培养技术, 对人ASCs 进行分离、体外培养及鉴定,为今后组织工程的深入研究打下基础。1 　材料与方法 实验材料　皮下脂肪组织20 mL , 取自一名35 岁健康女性, 由吉林大学第一医院整形外科手术切取。 试剂及仪器　高糖DMEM 培养基( Gibco) ,标准胎牛血清(广州赛业) , 胰蛋白酶、型胶原酶、地塞米松、胰岛素、维生素C、32异丙基212甲基2黄嘌呤( IBMX) 、油红O 染色剂、苏木精染色剂(Sigma) , β22 磷酸甘油(Amresco) , 吲哚美辛(临汾奇林药业) , 碱性磷酸酶(A KP) 检测试剂盒(南京建成生物) , CD44 、CD45 、CD49 、CD106 多克隆抗体及辣根酶标记羊抗兔IgG (北京博奥特生物) , 增强