色谱柱维护保.pptVIP

HPLC色谱柱的认识和维护;*;;*;HPLC色谱柱维护保养概要: 收到新的色谱柱 管路和接头 流动相注意事项 色谱柱的保护 保护柱 色谱柱的清洗 色谱柱的保存;核实色谱柱的信息 是你订购的色谱柱吗? 规格是否正确? 固定相是否正确? 检查物理性损坏 用标准测试样品在标准条件下测试柱子，以验证柱效 每支菲罗门色谱柱都经过单独检测;色谱性能取决于整个系统，而不仅仅是色谱柱 管路和接头会造成系统的死体积 系统死体积会导致: 峰展宽 峰形差 柱效降低 灵敏度降低;优化HPLC系统以获得最大性能 改变连接管路的内径（id） 0.17 mm id到0.12 mm id 减小流通池的体积 标准流通池 – 13 μL, 10 mm 路径 半微量流通池 – 5 μL, 6 mm 路径 条件 Luna? 3μm C18(2), 10 x 2.0 mm (MercuryMS?柱芯) 50:50 乙腈/水 ，0.2 mL/min HP1100 w/二元泵;优化前 峰宽 峰3: 0.072 min 峰4: 0.085 min 峰5: 0.103 min 分辨率 3/4 = 2.06 分辨率 4/5 = 1.89;泵到进样器 可以使用大一点的内径(0.010” = 0.254 mm) 进样器到色谱柱 管路内径最小化 通常使用0.007” (0.178 mm)或0.005” (0.127 mm) ID 色谱柱到检测器 管路内径最小化 大一些的内径会影响分离效果 通常使用0.007”或0.005” ID 检测器到废液瓶 可以使用更大的内径(?0.010”);*;并非所有的色谱柱和接头都一样 使用锥箍的种类/形状也各有不同 固定长度不同 (0.080”到0.130”) 固定长度很关键 管路一定要与色谱柱相匹配 不匹配的接头会导致死体积的增大或漏液 手紧接头 (聚合物的) 容易使用 一体的 符合柱头的形状;色谱柱柱头;不同厂商的接头;如果超出锥箍的管路长度过长，锥箍将固定不当，导致漏液;彻底冲洗HPLC泵和管路以去除气泡（打开冲洗阀来加速过程） 连接色谱柱和进样器 检查流向是否与色谱柱标签指示方向一致 流动相起始流速为0.1 mL/min，随后逐渐增大到正常流速 停止流速并将色谱柱与检测器入口连接 重启流速，用10-30个柱体积的流动相平衡色谱柱 含有离子对的流动相平衡所需时间更长;使用HPLC级溶剂 使用最高纯度的化学药品和试剂 使用前脱气和过滤所有流动相 保证溶剂是互溶的 验证缓冲盐在混合水/有机流动相中的溶解度 （尤其采用从高水相到高有机相的梯度洗脱时） 检查样品在流动相中的溶解度;流动相;保持pH在2.0到8.0之间（旧型硅胶和极性封尾相）或在1.5到10.0之间（新型硅胶） 低pH会使键合相从硅胶上断裂下来（水解） 高pH会使硅胶溶解 如在接近pH极限下运行时，使用预饱和柱将使这些影响降到最低 更新型的介质可以提供更宽的pH稳定性(1 – 12) ;背压通常保持在3500 psi以下（常规的HPLC柱和系统） UHPLC柱具有更高的压力限（≥9000 psi） 流速必须符合色谱柱的背压限 避免突然的压力变化 万一背压升高，可以反冲色谱柱（向色谱柱制造商核实一下）;为什么要这么做呢? 最大限度地延长色谱柱的寿命 减少系统损耗 从长远来看，可以节约时间和成本 获得最佳的结果 怎样去做? 流动相入口过滤头 在线过滤器 保护柱 流动相脱气 过滤所有流动相组分 过滤所有样品;样品基质是HPLC/UHPLC柱主要的污染物来源，常会导致: 背压升高 色谱性能降低 峰形问题（分叉，拖尾） 柱效降低 分辨率降低;在向HPLC/UHPLC柱进样前，去除潜在的污染物 过滤样品(0.45或0.2 μm针式滤头) 样品净化 – 例如SPE, 蛋白沉淀等;优点 通过去除颗粒和强保留的样品组分来保护昂贵的分析色谱柱 延长分析色谱柱的使用寿命 保持高柱效 节约成本 缺点 额外的管路和接头给系统增大了死体积 峰展变宽 保留时间变化;一种通用的保护柱系统 直接连接减少死体积 100%的惰性和生物相容性流路 PEEK（聚醚醚酮） 钛 专利设计 操作简易 物美价廉 通用的柱芯 ;Security Guard?;Security Guard?;保护使免受有害化学污染物和微粒的伤害 不会改变色谱图 操作简易 兼容几乎所有UHPLC、核-壳和亚-2 μm柱，2.0到4.6 mm ID 压力到20,000 psi (1,378 bar);延长色谱柱寿命;色谱柱的维护保养;咨询色谱柱制造商获取推荐的清洗程序和限制条件 采用不带缓冲盐的流动相冲洗色谱柱以去除缓冲盐 采用10倍柱体积的互溶溶剂冲洗，如甲醇或乙腈 采用20倍柱体积的强溶剂（THF或IPA）以去除强吸附样品组分 颠