不同浓度医用臭氧对大鼠星形胶质细胞.ppt

不同浓度医用臭氧对大鼠星形胶质细胞影响的体外观察 内容 研究的意义和主要内容 国内外研究进展 实验方法和内容 初步计划 经费预算 可行性预测 不利因素 参考文献 研究的意义和主要内容 医用臭氧是臭氧和氧气的混合物，应用于临床已有100多年的历史。医用臭氧技术在临床各专业中被广泛关注，并显示了良好的应用前景。在疼痛临床中，自1988年Verga将臭氧注入腰大肌及椎旁间隙治疗腰腿痛，臭氧开始越来越多的用于疼痛治疗。 研究的意义和主要内容 对于腰腿痛病人，医用臭氧椎间盘内和椎旁注射取得了良好的疗效。但是臭氧作为一种极强的氧化剂，在治疗过程中有可能会误入或渗入蛛网膜下腔，这是否会对中枢神经系统造成损伤，或是多大剂量能造成损伤，已经引起了临床医务工作者的关注和重视。 研究的意义和主要内容 星形胶质细胞作为中枢神经系统中数量最多的细胞，它的功能在近年来被人们越来越多地认识到，甚至有人把星形胶质细胞和神经元比作中枢神经系统中同等重要的功能伙伴。 研究的意义和主要内容 并且星形胶质细胞参与构成了血脑屏障，最先接触蛛网膜下腔中的毒性物质，而它本身也有强大的抗氧化能力，因此星形胶质细胞在抵抗臭氧的毒性作用中可能发挥了很大的作用，但广泛查阅未检索到相关报道。本研究拟从生化改变和形态学两方面观察不同浓度的医用臭氧对体外培养的星形胶质细胞的影响，以期为临床工作提供有意义的参考。 国内外研究进展 国内外关于臭氧的研究多集中于免疫系统、心血管系统、神经内分泌系统、呼吸系统等方面。在疼痛领域，对臭氧的研究都集中在臭氧的治疗作用，尤其是臭氧溶解椎间盘髓核作用和消炎止痛作用。 国内外研究进展 在臭氧的毒性方面，本科前期观察了不同浓度的医用臭氧2ml（30mg/L,50mg/L,80mg/L）经小脑延髓池注入蛛网膜下腔后，兔行为学未受到明显影响，而随着医用臭氧浓度的增加，脑脊液的抗氧化水平逐渐提高，脂质过氧化反应被抑制；当超出机体抵抗氧化的代偿能力时，抗氧化水平不再继续提高，脂质过氧化反应短暂增强。这表明随着剂量的增加医用臭氧鞘内注射有潜在的神经毒性，研究结果发表在中华麻醉学杂志上，这一结论为进一步研究医用臭氧的神经毒性提供了初步的研究结果。 国内外研究进展 但关于臭氧对离体细胞作用的研究，国外多是集中在臭氧对血液细胞和支气管上皮细胞的作用上，国内几乎没有在此方面的研究；而对于离体神经细胞的作用，国内外都没有相关文献报道。 实验方法和内容 1 星形胶质细胞培养 参照Kim 等人的方法，并略作改动。大致步骤如下： （1）取1～2天龄的大鼠，经75%乙醇消毒后，用手术剪将头部剪下，置于无菌培养皿中。 （2）沿纵轴剪开皮肤和颅骨，打开颅腔，取出脑组织并移入另一含有预冷生理盐水的培养皿中，去除嗅部，小心分离出两侧的大脑皮质。 注：在取材过程中，为防止污染，所用的消毒手术器械每一步骤均要加以更换。 实验方法和内容 1 星形胶质细胞培养 （3）小心地撕去脑膜，通常脑膜呈粉红色，若皮质组织已不见该颜色一般说明脑膜已去除干净。 （4） 将组织切成约0.2×0.2×0.2mm3大小的碎块后，移入另一含有9ml生理盐水的培养皿中。 （5） 加入无菌的1ml0.25% 胰蛋白酶液(预先用5%调节Ph7.3) , 置37℃水浴振荡消化20-30分钟。 实验方法和内容 1 星形胶质细胞培养 （6） 加入20ml含血清的DMEM完全培养基,并用吸管柔和的吹打3次。 （7） 静置数分钟待组织下沉后，将细胞悬液移入另一新的离心管，再加入15mlDMEM至剩余组织中，稍用力吹打3-4次后，再让组织下沉，收集细胞悬液。 实验方法和内容 1 星形胶质细胞培养 （8） 重复步骤（7）3-4次，直至组织全部分散成细胞悬液。将收集的细胞悬液用130um的筛网过滤。 （9） 过滤后的细胞悬液用50ml的无菌离心管分装，以1000r/min离心10min。 （10） 尽可能吸去上清液，每管加入10ml DMEM/F12，并柔和吹打3min,让细胞碎片和残余组织团块下沉后，收集细胞悬液。 （11） 用吸管将细胞悬液转移至细胞培养瓶，37C，5%CO2孵育40分钟，然后翻转培养瓶，将细胞悬液转移至另一培养瓶，重复此步骤3~4次以除去成纤维细胞。 实验方法和内容 1 星形胶质细胞培养 （12） 取0.1%苔盼蓝与细胞悬液以1：1稀释后，检查活细胞的数量，将细胞密度稀释成1.5× 106 ／ml , 接种入75cm2 的培养瓶中，5％C02／95％ 空气，37℃ ，饱和湿度培养。（培养液组成：DMEM /F12， 添加10％胎牛血清、4mmol／L 一谷氨酰胺、10万U青霉素／10万U链霉素、15mmol／LHEPES）。 (13) 接种三天后更换培养液，以后每隔两