感受态制备与化,质粒提取(原理和操作步骤).docVIP

感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤） 感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。 一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌 CaCl2法： 　　操作原理：　 1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜 HYPERLINK /view/2134605.htm \t _blank 磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞 　细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗 HYPERLINK /view/578185.htm \t _blank 脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。 2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 3.将转化后的细胞在 HYPERLINK /view/2392601.htm \t _blank 选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的 HYPERLINK /view/1357727.htm \t _blank 阳性克隆。 　意义： 　　 将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。 实验材料：E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。 试剂: 1.LB固体和液体培养基 2.Amp母液 (储存浓度 50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入 Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。?4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至 100ml,高压灭菌。5.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水 中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA(pH8.0)， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，28.5mL H2O)； 一、 受体菌的培养 -80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存。在划线板上做好相应标记，于37℃培养16-20小时。 在照过紫外的超净台中，用灼烧并冷却后的镊子夹住一个20μl枪头（或者灭过菌的牙签）， 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右(或过夜，220rpm),直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中（据其他资料：取50或100ul菌液接种于5ml的培养基中）,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.3~0.5左右。细胞数小于10的8次方, 过夜菌按比例转接至准备好的液体培养基中。一般转接菌液与培养基体积比例不得大于１:１０，即转接菌液:培养基体积≦ １:１０。 培养基体积与三角瓶体积比不得小于１:５，即培养基体积:三角瓶体积≧ １:５。 要有足够的空间提供溶氧。） OD值是一个重要的参数，当OD600值大于一定值时，菌体不会保持对数生长。同时， OD值大时菌体总量达，所以需要在这两个方面的影响中找到一个平衡点。不同的菌种所对应的值不一样。 二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将细菌悬液液转入离心管（1.5ml）中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。 2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaC