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DNA片段的回收 一. 【实验目的】 1.学习DNA片段纯化的原理和方法； 2.掌握利用试剂盒从凝胶中回收PCR产物的方法。 二. 【实验仪器与试剂】 1.实验仪器：琼脂糖凝胶电泳系统、紫外反射透射分析仪、离心机、恒温水浴锅、刀片、镊子 2.实验试剂：无水乙醇、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 其中琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒包含：吸附柱CA2、收集管（2ml）、平衡液BL、溶胶液PN、漂洗液PW、洗脱缓冲液EB，由TIANGEN公司提供。 三. 【实验原理】 切胶回收的主要目的是得到纯的目的DNA片段，去除影响DNA连接酶活性的物质以及其它的DNA片段。 琼脂糖凝胶电泳后，切取目的片段凝胶并打碎溶解，用盐溶液将DNA片段从凝胶中析出，沉淀后可得到较纯的目的片段。 四. 【实验内容与步骤】 1.使用TAE缓冲液制作1%的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。 2.将凝胶放入EB溶液中染色10分钟。 3.取一1.5mL离心管，称取重量M0。取出凝胶，在紫外光下切取目的条带，装入干净的离心管中，称取重量M1。计算M1-M0=M。 4.向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。（0.1g=100ul。注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱） 5.柱平衡：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500ul平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 6.将第4步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min ，12000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。吸附柱放回收集管中。 7.将吸附柱CA2放入收集管中，向吸附柱CA2中加入,600ul漂洗液PW,放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 8.重复步骤7。 9.将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2开盖置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响后续实验。 10.将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量(30ul)洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液。 11.为了提高DNA回收效率，再将离心管中的30ul洗脱缓冲液EB加入吸附柱CA2，室温放置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液。 五. 【实验结果与讨论】 现象描述及分析 本实验没有回收到目的DNA。可能的原因是：①实验操作不当导致吸附柱的吸附膜损害，没有吸附目的DNA。②胶条上没有DNA或DNA已降解。 附图 六. 【思考题】 1、DNA纯化的方法主要有哪些？ （1）对于染色体DNA或其他的大分子DNA的分离纯化: 在实验中分离的到的核酸样品根据不同的实验要求可以采用不同的方法进行纯化，例如超速离心、柱层析、分子杂交、免疫沉淀、凝胶电泳等。 （2）对于DNA片段的分离纯化： 在含有各种不同分子量大小的DNA混合物中，分离特定分子量的DNA片段，常用方法有低融点琼脂糖法、反复冻融法、电泳洗脱法玻璃粉末洗脱法等，也有现成的试剂盒供应。 3）大量提取的质粒DNA 一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化铯梯度离心法。常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。主要有聚乙二醇沉淀法、Sepharose 4B或Sephacel S-1000柱层析法、氯化铯——溴乙锭梯度平衡超速离心法、氯化铯——溴乙锭预制不连续密度梯度超速离心法。 2、试剂盒回收DNA片段回收率低的原因？ 胶块溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例; 胶块体积太大，应使用枪头捣碎，还不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回收; 紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量把切胶时间控制在30s以内; 洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率; TAE或TBE电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致PH值升高，降低DNA和膜的吸附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好。 回收前的样品量太少，加大点样量 洗脱前，预先65℃预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率30%以上。 3、DNA片段回收后可用于哪些实验操作？ 可用于连接转化、测序等实验操作。