01 实验一 蛋白质N末端氨基酸的鉴定(二甲氨基萘磺酰氯,DNS-Cl,胰岛素).pptVIP

实验一 二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）与氨基酸(多肽、蛋白质）N末端的氨基反应，分别生成有荧光标记的DNS-氨基酸（多肽、蛋白质），在紫外光照射时发出黄绿色荧光。 灵敏度10-10摩尔。 DNS-Cl标记氨基酸N末端 DNS化反应 胰岛素 DNS标记胰岛素N末端 用DNS-Cl标记胰岛素两条肽链的N末端 （A链N末端是Gly，B链N末端是Phe） DNS-胰岛素在6.0 mol/L盐酸中水解，释放 出带有DNS荧光标记的DNS-Gly和DNS-Phe。 （其余的氨基酸不带DNS标记） DNS-胰岛素的水解 DNS标记氨基酸标准品的N末端 用DNS-Cl标记氨基酸标准品的N末端。 （本实验只标记Gly和Phe两种氨基酸标准品） 聚酰胺薄膜层析 分离原理：各种被分离化合物在展层剂中的溶解度及其与聚酰胺形成氢键能力的大小的不同，决定它们在展层过程中迁移的速度差异。 己二酸和己二胺的聚合物，含有大量酰胺基团。 nHOOC(CH2)4COOH + nH2N(CH2)6NH2 → -HN-CO-(CH2)4-CO-NH(CH2)6NH-CO- 己二酸 己二胺 聚酰胺 聚酰胺 聚酰胺薄膜 将聚酰胺涂在涤纶基片上，干燥后制得聚酰胺薄膜。它含有大量-CO-和-NH-，能与被分离的化合物形成氢键，用于分离酚类、酸类、醌类、硝基及胺基化合物。 Rf值（相对迁移率） A：样品起点 C：层析终止时样品的中心 B：溶剂前沿 B C2 A C1 Rf = AC／AB 实 验 操 作 1.取2支小试管（清洗干净） Phe：0.20 mL Phe ＋ 0.20 mL DNS-Cl Gly：0.20 mL Gly ＋ 0.20 mL DNS-Cl 2.薄膜封口，40oC水浴反应20 min 3.在酒精灯上将液体蒸干 4.各加入0.10 mL 1.0 mol/L HCl DNS-Cl标记氨基酸标准品 1.取1支小试管（清洗干净） 0.20 mL Phe ＋ 0.20 mL DNS-Cl； 2.薄膜封口，40oC水浴反应20 min； 3.在酒精灯上将液体蒸干。 DNS-Cl标记胰岛素 老师准备！ DNS-胰岛素的水解 1.加0.50 mL 6.0 mol/L HCl，封口； 2.110oC水解12-18小时； 3.在电炉上蒸发干液体； 4.加入0.10 mL 1.0 mol/L HCl。 1.将0.10 mL DNS-Gly和0.10 mL DNS-Phe 分别转入0.5 mL离心管中。 2.各加入0.10 mL乙酸乙酯，剧烈振 荡2 min，静置待用。 DNS-氨基酸的萃取 取2只0.5 mL离心管，做好标记（Gly、Phe） 点 样 注意 1.用铅笔轻轻标记点样点 2.点样点距薄膜底端1.0 cm 3.用玻璃毛细管点样 1.0 cm 展 层 展层及结果观察 展层剂：甲酸（88%）：水 = 1.5 ：100（V/V） 1.将点样后的薄膜弯曲成筒状，用胶带固定； 2.展层5-6 min，溶剂前沿到达距薄膜顶端1.0 cm 时，停止展层； 3.标记溶剂前沿； 4.吹干薄膜，在紫外分析仪中观察结果。 预期结果 展层起点 展层方向 1.0 cm 1 2 3 溶剂前沿 DNS-氨基酸双向展层 试剂配制 DNS-Cl溶液：2.5 mg/mL，用丙酮配制，在棕色试剂瓶中保存。 Gly溶液：0.40 mg，加1.0 mL 0.20 mol/L NaHCO3 Phe溶液：0.96 mg，加1.0 mL 0.20 mol/L NaHCO3 试剂配制 0.20 mol/NaHCO3溶液：（84.01 g/mol） 16.8 g，加1000 mL水。 1.0 mol/L HCl溶液：50 mL浓HCl，