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EASY 克隆 - 北京全式金生物(TransGen Biotech) 官方主页
EASY 克隆“1+1”
——5分钟快速、高效克隆
北京全式金生物技术有限公司
分子克隆的传统方法
Topoisomerase (EASY)克隆原理
EASY 克隆策略
EASY 克隆的几个细节
无缝拼接基因克隆
Some slides are copied from several web sites.
Thanks to all of these unknown contributors!
分子克隆的传统方法
分子克隆的传统方法
连接和环化
• 常规的连接是一个三分子共同反应的过程。
• TA克隆中粘性末端仅有一个碱基,因此较高
的DNA浓度和较高T4连接酶浓度是获得较高
连接效率的前提。
• 环化过程恰恰与连接过程相反,过高的DNA浓度和T4连接酶浓度会增加分子间
相互作用促进串连体(concatemer)形成。
• 通常情况下, 克隆效率(连接产物转化效率,而不是克隆阳性率)低于0.1% 。
Topoisomerase (EASY)克隆原理
拓扑异构酶的功能
Vaccina Topoisomerase as Cloning Tool
• Specific DNA cleavage and binding by vaccinia virus DNA topoisomerase I. S Shuman and J Prescott .
J. Biol. Chem., Vol. 265, Issue 29, 17826-17836, Oct, 1990
• Site-specific interaction of vaccinia virus topoisomerase I with duplex DNA. Minimal DNA substrate for strand
cleavage in vitro. S Shuman . J. Biol. Chem., Vol. 266, Issue 17, 11372-11379, Jun, 1991
• Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase. S Shuman
J. Biol. Chem., Vol. 269, Issue 51, 32678-32684, 12, 1994
EASY 克隆原理
连接反应成为一
个双分子作用的
过程
TOPO载体反应动态平衡
Mary R. Stahley and James T. Stivers Biochemistry.2010 April 6: 49(13):2786-2795
Reversible DNA cleavage and ligation by topoisomerase IB and DNA strand exchange. The native strand (black) is cleaved during the
first transesterification reaction, and can dissociate from the Topo-DNA covalent complex. Another DNA strand with a 5-OH (red)
can associate and attack the DNA-protein phosphotyrosyl bond, resulting in DNA rearrangements.
传统TA载体和TOPO载体稳定性、自连率的比较
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