DNA重组技术.pptVIP

一 DNA的体外重组（切与接） 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用。 一般说来在选择外源DNA同载体分子连接反应程序时，需要考虑到下列三个因素： (1) 实验步骤要尽可能地简单易行， (2) 连接形成的“接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段， (3) 对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。? 二 用于基因转移的受体菌或细胞 A 受体细胞应具备的条件 一、宿主的选择 从安全性考试，应具备以下条件： 1. 不适合在人体内生存 2. 不适合在非培养条件下生存 3. 在非培养条件下，其DNA容易解体 4. 它的DNA不易转移 5. 它的质粒只在这一宿主由复制 6. 便于检测 A 受体细胞应具备的条件 从遗传性考虑： 1.重组缺陷型recA－，用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-） 2.限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免对外源DNA的除解。外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 3.与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与载体选择标记互补的表型） 4. 具有较高的转化效率 三 重组DNA分子的转化和扩增（转与增） 四 转化子的筛选和鉴定（检） 四 转化子的筛选和鉴定（检） 胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（thymidine Kinase,TK）在所有真核细胞中都有表达, 是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶, 它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP, 继续磷酸化生成dTTP, 参与DNA的生物合成。 在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。 双脱氧终止法测序反应体系包括： DNA聚合酶 单链DNA模板 带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物 Mg2+ 4种dNTP(aATP,dGTP,dCTP和dTTP) 4种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP) Sanger法DNA测序的试剂 ① 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构 ② 模板 ③ DNA聚合酶 ④ 2′，3 ′-双脱氧核苷三磷酸 （ 2′, 3 ′-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP ） ⑤ dNTP B 转化率 转化率的影响因素 转化方法方面： 受体细胞的预处理：影响最大 供受体的比例： Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA 转化方法： Ca2+诱导转化 106 - 107 / mg DNA 原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA 原生质体转化 105 - 106 / mg DNA l-DNA转染 107 - 108 / mg DNA 电穿孔转化 106 - 109 / mg DNA C 转化细胞的扩增 扩增操作 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时 原生质体转化后的再生过程 l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作 C 转化细胞的扩增 扩增操作的目的 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定 载体遗传标记检测 克隆DNA序列检测 外源基因产物检测 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子 转化子 重组子 目的重组子 A载体遗传标记检测 抗药性筛选法 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r 抗药性筛选法的基本原理： pBR322 4363 bp ori 抗药性筛选法可区分转化子与非 转化子、重组子与非重组子 将外源DNA片段插在EcoRI位点： 非重